大鼠慢性肝損傷的線粒體功能障礙及其影響

張靚睿，王詩琪，王紅昀，董若瑤，孟勝男

（中國醫科大學藥學院藥劑學教研室，沈陽 110122）

近年來，肝病的發病率逐年增高，肝損傷已經成為臨床上威脅人類健康的常見殺手之一。造成肝損傷的原因主要有藥物性肝損傷、酒精性肝損傷和化學性肝損傷［1］。慢性肝損傷病程長，過程反復，可發展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌［2］，因此，慢性肝損傷的病因機制亟待研究。肝臟受損實質是肝細胞損傷，肝細胞內有多種細胞器，其中線粒體是肝臟中物質代謝和能量代謝的中心［3］，與肝臟的代謝功能相輔相成。研究［4］發現，大鼠肝纖維化模型中觀察到肝細胞線粒體腫脹變形，結構模糊，嵴減少、扭曲。肝細胞壞死在很大程度上還涉及細胞信號傳導途徑的激活。然而，在壞死細胞裂解期間細胞內組分的釋放導致離子失衡，線粒體功能障礙，三磷酸腺苷 （adenosine triphosphate，ATP） 消耗并引發炎癥反應［5］。本研究通過成功建立四氯化碳誘導大鼠慢性肝損傷模型，從線粒體功能、形態、電子傳遞等方面闡述了線粒體與肝損傷疾病的緊密聯系，為臨床探究慢性肝損傷疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠，體質量180～200 g，中國醫科大學動物實驗中心提供，許可證號SCXK［京］2011-0011。

1.2 藥品與試劑

50%四氯化碳大豆油溶液：四氯化碳 （分析純）購自北京化學試劑有限公司，大豆油購自山東魯花集團有限公司。線粒體提取試劑盒 （批號SM0020），線粒體膜電位檢測試劑盒 （JC-10） （批號CA1310） 均購自北京索萊寶科技有限公司，ATP檢測試劑盒 （批號S0026） 購自碧云天生物技術研究所，輔酶ⅠNAD（H） 試劑盒 （批號A114-1-1） 購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗儀器

DY89-9電動玻璃勻漿器 （寧波新芝生物科技有限公司），3k15高速冷凍離心機 （德國Sigma公司），BioSpectrometer紫外分光光度計 （德國艾本德Eppendorf公司），imark酶標儀 （美國Bio-Rad公司），SynergyTMHT多功能酶標儀 （LB-940，美國Bio-tek公司），C2激光共聚焦顯微鏡 （日本尼康公司），超低溫冰箱 （美國Thermo Fisher公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物造模、分組：選取雄性SD大鼠40只，體質量180～200 g，按照體質量隨機分為空白對照組和四氯化碳慢性肝損傷模型組2組，每組20只。四氯化碳慢性肝損傷模型組大鼠皮下注射50%四氯化碳大豆油溶液，每次給予0.2 mL/100 g，每周2次，連續10周。于造模第4周，第6周，第8周，第10周末次給藥后，各組隨機選取5只大鼠，禁食不禁水20 h，給予10%水合氯醛，按0.3 mL/kg腹腔注射麻醉，分離大鼠肝臟組織，選取肝臟大葉組織用于線粒體提取，其余置于-80 ℃ 保存待用。

1.4.2 大鼠肝臟組織線粒體提取與分離：應用線粒體提取試劑盒分離大鼠肝臟組織胞質與線粒體，按照試劑盒說明書操作。分離后得到的線粒體用于線粒體膜電位檢測與線粒體膜腫脹度檢測，具體提取分離方法為取200 mg肝組織，PBS沖洗后剪碎，放入玻璃勻漿器，加入1 mL Lysis Buffer，于冰浴研磨，將組織勻漿物4 ℃，1 000g，離心5 min，取上清，4 ℃，1 000g再次離心5 min。取上清，4 ℃，12 000g離心10 min，取上清，該上清含胞漿成分，置-80 ℃ 備用。向沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重懸線粒體，4 ℃，1 000g離心5 min。取上清，4 ℃，12 000g離心10 min，棄上清，加入50～100 μL Store Buffer重懸線粒體沉淀，-80 ℃保存備用。

1.4.3 肝組織線粒體膜電位檢測：按照線粒體膜電位檢測試劑盒 （JC-10） 說明書操作。取適量JC-10（200×） 染色液，按照每50 μL JC-10 （200×） 加入8 mL超純水的比例稀釋JC-10，充分溶解并混勻，再加入2 mL JC-10染色緩沖液 （5×），混勻，即為JC-10染色工作液。將工作液稀釋5倍，再加入0.1 mL總蛋白量為100 μg線粒體，應用激光共聚焦顯微鏡觀測熒光。

1.4.4 肝組織線粒體膜腫脹度檢測［6］：配制反應緩沖液 （蔗糖250 mmol/L，磷酸二氫鉀5 mmol/L，氯化鈣0.3 mmol/L，琥珀酸鈉3 mmol/L，pH7.4），調節線粒體濃度至0.5 mg/mL，應用參比杯調零，于25 ℃ 在10 min內連續測定520 nm處的吸光度值，以吸光度的下降值反應線粒體的腫脹程度。

1.4.5 ATP含量檢測：采用ATP檢測試劑盒測定對照組與模型組肝臟ATP含量，按照說明書操作。每20 mg組織加入約200 μL裂解液，充分勻漿確保組織被完全裂解。裂解后4 ℃，12 000g離心5 min，取上清。配制ATP檢測工作液，采用ATP檢測工作液于多功能酶標儀測定相對光單位（relative light unit，RLU）值，根據標準曲線計算肝臟組織中線粒體ATP濃度。

1.4.6 輔酶ⅠNAD （H） 含量檢測：按照輔酶ⅠNAD（H） 含量檢測試劑盒說明書操作。每100 mg組織加入1 mL酸/堿性提取液，冰浴研磨，煮沸5 min，冷卻后4 ℃，10 000g離心10 min，取上清液，加入等體積酸/堿性提取液使之中和，混勻，4 ℃，10 000g離心10 min，取上清。加入檢測試劑，混勻，應用蒸餾水調零，于紫外分光光度計測定570 nm處吸光度值。

1.5 統計學分析

數據采用GraphPad Prism 5統計學軟件進行分析，結果以表示，組間均數比較采用Student’st檢驗，P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四氯化碳致大鼠慢性肝損傷對肝臟線粒體膜電位的影響

使用激光共聚焦顯微鏡分別觀察對照組與模型組線粒體膜電位水平，紅色熒光表示線粒體膜電位較高，提示線粒體膜電位正常，綠色熒光表示線粒體膜電位較低，提示線粒體膜電位受損，與對照組相比，模型組大鼠肝臟線粒體膜電位紅綠熒光比值顯著降低，且隨造模時間延長，紅色熒光強度呈下降趨勢，綠色熒光強度呈上升趨勢，紅綠熒光強度比值亦有所下降。可見紅綠色熒光比值具有時間依賴性。結果提示，模型組大鼠肝臟線粒體受損，且隨造模時間延長，肝臟線粒體受損程度增加。見圖1。

2.2 四氯化碳致大鼠慢性肝損傷對肝臟線粒體膜腫脹度的影響

如圖2所示，加入線粒體膜腫脹度檢測液后，在520 nm處各組吸光度值均下降，模型組吸光度值的下降幅度顯著低于對照組 （P< 0.01）。且隨造模時間的延長，模型組吸光度值下降幅度逐漸減弱。造模4周、6周后，模型組吸光度值有下降趨勢，但與對照組相比，無統計學差異。造模8周、10周后，模型組吸光度值與對照組相比，下降幅度減弱，有統計學差異 （P< 0.05），結果提示，模型組大鼠肝臟線粒體膜敏感性降低，造成線粒體損傷。

圖1 線粒體膜電位熒光圖Fig.1 Mitochondrial membrane potential fluorescence

圖2 線粒體腫脹程度Fig.2 Degree of mitochondrial swelling

2.3 四氯化碳致大鼠慢性肝損傷對肝臟線粒體ATP合成的影響

在四氯化碳致大鼠慢性肝損傷制備4周、6周、8周、10周后，模型組ATP含量分別為 （6.08±0.53）nmol/L，（3.97±1.04） nmol/L，（3.71±0.59） nmol/L，（4.39±0.75） nmol/L，對照組ATP含量分別為 （23.58±3.41） nmol/L，（26.78±3.06） nmol/L，（30.17±1.41）nmol/L，（26.75±3.45） nmol/L，比較2組ATP含量差異發現模型組ATP水平顯著低于對照組 （P< 0.001），且差異均有統計學意義 （P< 0.001）。結果提示，四氯化碳致大鼠慢性肝損傷導致線粒體ATP合成受損，表示線粒體功能損傷。

2.4 四氯化碳致大鼠慢性肝損傷對肝臟線粒體NADH/NAD+比值的影響

NADH/NAD+比值代表肝細胞線粒體內三羧酸循環的功能，比值升高，提示三羧酸循環受損，表明肝細胞線粒體損傷。造模4周后，模型組與對照組NADH/NAD+比值分別為0.58±0.06與0.41±0.06，差異無統計學意義。造模6周、8周、10周后，模型組與對照組NADH/NAD+比值分別為1.86±0.22，3.86±0.17，5.27±0.27與0.38±0.09，0.78±0.06，0.49±0.06，相比于對照組，模型組線粒體NADH/NAD+比值均顯著升高，差異有統計學意義 （P<0.001）。結果提示，四氯化碳致大鼠慢性肝損傷模型組肝細胞線粒體三羧酸循環受損，肝細胞線粒體功能障礙。

3 討論

肝臟是人體中的重要器官，在物質代謝，解毒和排泄中起決定性作用［7］。四氯化碳誘導慢性肝損傷作為經典模型，已被廣泛應用［8］，該模型涉及四氯化碳可經肝臟細胞色素酶代謝產生自由基［9］，共價結合細胞內或細胞膜的大分子，使細胞內酶功能喪失，線粒體損傷及細胞凋亡［10］。在本研究中，應用此經典模型探討肝臟疾病與線粒體功能障礙的關聯及其所致影響。

線粒體是生物體能量中心，是細胞進行有氧呼吸的重要場所［11］。其參與真核生物的氧化代謝，能量轉化，三羧酸循壞，氧化磷酸化，主導合成ATP。主要功能包括調節細胞膜電位，控制細胞程序性死亡，調控細胞增殖與代謝［12］。大量研究［13-15］表明，線粒體膜電位水平是評判線粒體生物功能的標志物，線粒體膜電位水平下降，提示線粒體生物功能障礙［15］。本研究應用激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體膜電位水平，發現模型組線粒體膜電位水平顯著低于對照組，表明模型組線粒體膜電位受損，提示四氯化碳誘導慢性肝損傷時，線粒體功能下降及活性降低，與研究［16］結果一致。本研究通過高鈣濃度引發線粒體腫脹，當線粒體膜受損時，它對高鈣敏感度降低，表現為吸光度下降幅度減小［6］。本研究結果表明，模型組吸光度下降幅度較對照組有所減小，且隨造模時間延長，吸光度下降幅度差異增加，提示隨肝損傷程度增加，線粒體膜受損程度增加。有研究［17］表明當線粒體膜電位紊亂時，細胞內ATP合成受損，氧化磷酸化水平降低。本研究發現，肝損傷模型組ATP水平顯著低于對照組，表明模型組肝臟線粒體產生ATP減少，提示慢性肝損傷模型下，ATP合成受損，能量代謝受損，可致線粒體氧化應激發生，促進炎性細胞因子的釋放與激活［18］。輔酶ⅠNAD （H） 廣泛存在于生物體內，主要參與生物體內線粒體呼吸鏈電子傳遞［19］。NAD （H） 含量及NADH/NAD+比值的高低可用于評價線粒體內三羧酸循環功能的強弱，較高的NAD （H） 及NADH/NAD+比值表明細胞呼吸鏈電子傳遞被抑制，損害線粒體功能［16］。本研究結果顯示，慢性肝損傷模型組NADH/NAD+比值顯著高于對照組，且隨造模時間延長，NADH/NAD+比值顯著提高，提示線粒體呼吸鏈功能受損，延長造模時間，則線粒體呼吸鏈損傷程度加重。

綜上所述，四氯化碳誘導大鼠慢性肝損傷模型中，線粒體生物功能受損，膜穩定性降低，能量代謝及氧化磷酸化被抑制，表明線粒體損傷是四氯化碳引起慢性肝損傷的必要環節。線粒體損傷致肝臟能量代謝異常，表明肝損傷疾病與能量代謝密切相關，因此，研究線粒體生物功能及能量代謝情況在研究肝臟疾病的發生發展中具有重要作用。