膽維丁乳對急性肺損傷小鼠肺表面活性物質的影響

李野，李斌超，張雅琳，劉寧，劉祖望，孔娟

（中國醫科大學附屬盛京醫院臨床營養科，沈陽 110004）

急性肺損傷 （acute lung injury，ALI） 是肺泡上皮細胞和肺毛細血管內皮細胞受損的急性肺部炎癥綜合征 （acute respiratory distress syndrome，ARDS）［1］，是一種高死亡率的急危重癥。通過氣管滴注脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）可建立ALI 小鼠模型［2］。

肺表面活性物質由Ⅱ型肺泡上皮細胞分泌，主要成分為二棕櫚酰卵磷脂和肺表面活性物質結合蛋白 （surfactant protein，SP），分布于肺泡液體分子層表面，能降低肺泡表面張力，維持大小肺泡容量的相對穩定［3］，阻止肺泡毛細血管中液體向肺泡內濾出，是治療ALI的有效手段［4］。目前已知的SP有SP-A、SP-B、SP-C、SP-D 4種。維生素D是一種脂溶性類固醇激素，在鈣磷平衡和骨代謝中起重要作用［5-7］，并可通過其受體 （vitamin D receptor，VDR） 調控多種生理反應［2，8-16］。研究［17-19］發現，維生素D3能調節Ⅱ型肺泡上皮細胞增殖。膽維丁乳 （cholecalciterol cholesterol emulsion，CCE） 是一種新型的活性維生素D前體，臨床上常用于治療嬰幼兒維生素D缺乏性佝僂病。SP在維生素D缺乏小鼠的肺中表達減少［20］。本研究擬探討CCE對LPS所致ALI肺表面活性物質的影響。

1 材料與方法

1.1 制作動物模型與分組

將36只健康雄性BALB/c小鼠隨機分為正常對照組、CCE組、LPS組、LPS+CCE組，每組9只。正常對照組和LPS組給予飲用水，CCE組和LPS+CCE組小鼠給予10%CCE水溶液 （避光，購自中國醫科大學附屬盛京醫院）。飼喂14 d后，LPS 組和LPS+CCE組小鼠行氣管切開，滴注LPS （10 mg/kg），24 h后取血清、肺泡灌洗液及肺組織備用。

1.2 檢測血清鈣、磷的含量

從小鼠心臟取血，分離血清，采用鈣測試盒 （帶標準） 微板法 （C004-2，南京建成生物工程研究所）、無機磷測試盒 （C006-1，南京建成生物工程研究所）檢測各組小鼠血清鈣、磷含量。

1.3 測定小鼠肺組織濕/干質量比

取4組小鼠的右下肺，用吸水紙吸干肺組織表面血跡，立即稱質量，記為“濕質量”。置于80 ℃恒溫干燥箱內烘干，48 h后稱質量，記為“干質量”。計算肺濕/干質量比。

1.4 肺組織HE染色

4%多聚甲醛固定肺組織，石蠟包埋并切片，脫蠟，HE染色，封片，光鏡下觀察并拍照。

1.5 實時PCR

用TRIzol試劑盒 （美國Invitrogen公司） 提取肺組織總RNA，按照產品說明書操作。用生物分光光度計測定RNA濃度和純度。取2 μg RNA樣本，用TaKaRa逆轉錄試劑盒 （A2302-1，日本TaKaRa公司）進行逆轉錄合成cDNA，并以此為模板進行PCR擴增反應。逆轉錄和PCR反應條件按照試劑盒說明書設置。引物由上海生工生物工程公司合成，見表1。

1.6 Western blotting

取肺組織，研磨勻漿后，蛋白裂解，BCA法檢測總蛋白濃度。取50 μg總蛋白，行SDS-PAGE電泳，電轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗（VDR抗體 1：1 000稀釋，購自美國SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司；GAPDH抗體 1 ∶5 000稀釋，購自美國Proteintech公司），4 ℃孵育過夜。TBST洗3次，室溫孵育二抗1 h，ECL顯色。Image J圖像分析軟件對條帶進行定量分析比較。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

1.7 繪制生存曲線

另取健康雄性BALB/c小鼠20只，分為LPS組、LPS+CCE組，每組10只，處置同1.1，繪制并分析2組小鼠生存時間曲線。

1.8 統計學分析

采用Graph Pad Prism 5.0軟件進行統計學分析，計量結果均采用表示，采用方差分析或配對t檢驗進行組間比較。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCE對ALI模型小鼠血清鈣、磷含量的影響

如表2所示，喂飼CCE 2周后，4組小鼠血清鈣、磷水平無統計學差異。說明CCE對LPS所致ALI模型小鼠血清鈣、磷的影響較小，故可排除血清鈣、磷水平的高低對實驗結果的干擾。

2.2 CCE對ALI模型小鼠生存時間的影響

如圖1所示，LPS+CCE組小鼠平均生存時間長于LPS組，小鼠死亡的首發時間晚于LPS組，給予LPS處理后25 h，LPS+CCE組小鼠仍有80%存活，LPS組則有40%小鼠死亡；53 h以內LPS組小鼠全部死亡，2組小鼠生存時間有顯著的統計學差異 （P< 0.05）。表明CCE能顯著延長ALI小鼠的生存時間，對ALI起保護作用。

2.3 CCE對ALI模型小鼠肺組織及肺水腫的影響

肉眼觀察可見，與正常對照組相比，LPS組小鼠雙肺腫脹，體積變大，肺表面可見出血區。光鏡下（圖2A） 可見，正常對照組與CCE組小鼠肺泡結構完整，肺泡腔和間隙內無炎癥細胞浸潤；LPS組小鼠肺泡和肺間質廣泛充血、水腫、大量炎性滲出液，肺泡腔可見破裂的紅細胞和滲出物，肺泡結構紊亂，肺泡腔狹窄，肺泡間隔增厚；與LPS組相比，LPS+CCE組小鼠肺泡和肺間質微血管充血擴張程度及炎癥細胞浸潤減輕，肺泡腔內紅細胞減少。

表2 4組小鼠血清鈣、磷含量 （，n=9）Tab.2 Serum calcium and phosphorus contents in 4 groups （，n=9）

表2 4組小鼠血清鈣、磷含量 （，n=9）Tab.2 Serum calcium and phosphorus contents in 4 groups （，n=9）

CCE，cholecalciterol cholesterol emulsion；LPS，lipopolysaccharides.

圖1 Kaplan-Meier法測定LPS誘導的ALI小鼠生存曲線 （n=10）Fig.1 The survival curve of ALI mice induced by LPS determined by Kaplan-Meier method （n=10）

為了觀察ALI時肺泡和肺間質充血、水腫的程度，本研究進一步檢測了肺濕/干質量比。結果如圖2B所示，LPS組小鼠肺濕/干質量高于正常對照組，差異有統計學意義 （P< 0.01）；LPS+CCE組較LPS組顯著降低，差異有統計學意義 （P=0.023）。提示CCE能改善ALI肺組織水腫程度。

2.4 CCE對ALI模型小鼠肺中VDR表達的影響

圖2 CCE對ALI小鼠肺組織病理變化及水腫程度的影響Fig.2 The effect of CCE on the pathological changes of lung tissue and the degree of edema in ALI mice

Western blotting和實時PCR結果如圖3所示，CCE 組小鼠肺組織中VDR蛋白表達水平高于正常對照組，LPS+CCE組VDR蛋白表達水平高于LPS組，差異有統計學意義 （P=0.012，P=0.005）。提示飼喂CCE能增加小鼠肺組織內VDR表達。

2.5 CCE對ALI模型小鼠肺組織SP-A、SP-B、SP-C、SP-D mRNA表達的影響

如表3所示，CCE小鼠肺組織SP-A、SP-C和SP-D的表達水平高于正常對照組，差異有統計學意義（P=0.007，P=0.011，P=0.006）；與正常對照組相比，LPS組SP-A、SP-B、SP-C、SP-D的表達水平均顯著下降 （P=0.006，P=0.016，P=0.001，P=0.001），而LPS+CCE組SP-A、SP-B、SP-C、SP-D的表達水平均較LPS組顯著上升 （P=0.001，P=0.049，P=0.001，P=0.042），差異有統計學意義。表明CCE能促進小鼠肺泡中肺表面活性物質的產生。

3 討論

盡管臨床研究［21-22］發現，活性維生素D可影響血清鈣磷水平，但本研究結果顯示CCE并未影響小鼠的血清鈣磷水平，因此排除了血清鈣磷對后續實驗結果的影響。

圖3 小鼠肺組織VDR蛋白及mRNA表達情況Fig.3 Expression of VDR protein and mRNA in the lungs of mice

表3 各組小鼠肺中SP-A、SP-B、SP-C、SP-D mRNA表達水平比較 （n=9）Tab.3 Comparison of the mRNA expression levels of SP-A，SP-B，SP-C and SP-D in the lungs of mice in each group （n=9）

本研究發現，LPS+CCE組小鼠死亡首發時間晚于LPS組，且平均生存時間長于LPS組，提示維生素D前體CCE有顯著延長ALI小鼠生存時間的作用，原因可能與維生素D的抗炎特性有關［23-24］。本研究還發現，CCE具有減輕ALI所致肺組織損傷的作用。HE染色顯示，LPS組小鼠肺組織可見肺泡上皮細胞及間質水腫、肺泡腔內滲出、充血、炎癥細胞浸潤等典型ALI病理改變［25］，而LPS+CCE組ALI病理改變較LPS組減輕。小鼠肺濕/干質量比能反映ALI所致肺水腫的程度，ALI時肺水腫嚴重，肺濕/干質量比升高［26］。本研究結果顯示，LPS+CCE組肺濕/干質量比較LPS組降低，提示CCE在一定程度上緩解了LPS對小鼠造成的ALI肺水腫。

本研究發現，與正常對照組和LPS組相比，CCE組和LPS+CCE組小鼠肺組織內VDR表達水平顯著升高，表明飼喂CCE能使小鼠體內VDR表達增多。研究［27-29］表明，ALI會造成肺泡不穩定、肺泡去復張及相應的組織重塑，肺表面活性物質可降低肺泡表面張力，從而防止低肺容量時發生肺泡塌陷及水腫［30-31］，因此增加肺表面活性物質可治療ALI［4］。維生素D3可加速胎兒肺成熟和Ⅱ型肺泡上皮細胞分化，并增加大鼠肺組織和Ⅱ型肺泡上皮細胞中肺表面活性物質的表達和分泌［32-34］。有研究［35］表明，維生素D3可直接作用于原代培養的Ⅱ型肺泡上皮細胞，誘導SP-BmRNA的產生，故推測維生素D前體CCE對ALI的保護作用有可能是因為增加了肺表面活性物質，因此本研究檢測了各組小鼠肺組織中SP-A、SP-B、SP-C、SP-D的表達情況，結果證實CCE確能增加SP的表達。

綜上所述，本研究證實了維生素D前體物質CCE能緩解LPS造成的ALI，改善并延長ALI小鼠的生存時間，改善肺組織病理學變化及肺水腫，增加SP的表達。因此，維生素D前體CCE增加肺表面活性物質可能是緩解ALI的機制之一，為探索ALI治療方法提供了新的思路。