三種支鏈氨基酸對小麥秸稈瘤胃體外發酵特性的影響

常 樂

（長治職業技術學院生物工程系，山西長治 046011）

牧草是反芻動物正常瘤胃功能所必需的，為反芻動物提供一種更經濟有效的飼養方式。但牧草中高比例的結構性碳水化合物限制了反芻動物對牧草的自由采食和消化，因為它們減慢了微生物的發酵速度。瘤胃微生物，尤其是纖維素分解菌和厭氧真菌的數量和多樣性是降解日糧纖維成分的必要條件（Wilson，2008）。因此，一種促進纖維降解微生物生長的方法將有利于增加瘤胃中纖維素和半纖維素的降解。大多數瘤胃纖維素降解微生物（如白瘤胃球菌、風味瘤胃球菌、琥珀纖維桿菌和丁里維生物纖維隔離菌）都需要支鏈揮發性脂肪酸，如異丁酸、異戊酸和2-甲基丁酸（侯明杰等，2018）。瘤胃支鏈揮發性脂肪酸主要來源于日糧蛋白或細菌蛋白經瘤胃氧化脫氨和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸脫羧后的循環。Moharrery（2004）研究表明，支鏈揮發性脂肪酸可以提高綿羊瘤胃的干物質表觀消化率和微生物生長，增強微生物功能和酶活性。支鏈揮發性脂肪酸可以、用于合成支鏈氨基酸，即纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。氨基酸通常對瘤胃微生物具有刺激作用，即使氨和碳水化合物超出所需，說明氨基酸直接影響瘤胃微生物的生長速率。Yang（2002）在體外試驗中發現，支鏈揮發性脂肪酸顯著提高了牧草中性洗滌纖消化率，而支鏈氨基酸的效果更佳。但每種支鏈氨基酸用于瘤胃發酵和底物降解的最佳劑量仍然未知。支鏈氨基酸對纖維物質體外降解的數據較為有限。因此，本試驗評估了不同劑量的纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸對小麥秸稈體外瘤胃發酵特性的影響。

1 材料與方法

1.1 瘤胃液接種試驗選擇4頭帶有瘤胃瘺管的綿羊作為瘤胃液供體，飼喂商品濃縮料和補充小麥秸稈。在早上飼喂前從瘤胃瘺管收集內容物，經4層紗布過濾去除飼料顆粒。過濾后的瘤胃液轉移到一個預加熱（38℃）的保溫瓶中，并與二氧化碳混合，并加入緩沖液。

1.2 樣品孵育取1 g小麥秸稈樣品放入125 mL血清瓶。在每個發酵瓶中加入稱重的纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸，配制成濃度梯度為1、3、5和7 mmol/L。將100 mL瘤胃液加入到瓶中，用二氧化碳沖洗，之后裝上塞子，密封，并在38℃的水浴搖床（100 rpm/min）。未添加支鏈氨基酸的瓶子作為對照組，每組3個重復。孵育72 h后，用自來水冷卻，停止發酵。用pH計測定培育基的pH。用尼龍袋過濾每個瓶子的內容物，收集底物殘渣測定干物質和中性洗滌纖維。收集每個過濾發酵液10 mL，用于測定氨氮和揮發性脂肪酸濃度（Filipek 和 Dvorak，2009）。

1.3 統計分析數據采用SPSS軟件一般線性模型進行分析，采用Duncan’s法進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，同時利用正交多項式分析支鏈氨基酸添加水平的線性和二次曲線效應。

2 結果與分析

2.1 纈氨酸對小麥秸稈體外發酵性能的影響由表1可知，添加纈氨酸對培養基的最終pH無顯著影響（P＞0.05）。氨氮濃度隨纈氨酸添加水平的增加有顯著上升趨勢（P=0.06）。與對照組相比，纈氨酸濃度在1 mmol/L或更高水平時，揮發性脂肪酸產量顯著增加（P＜0.05）。揮發性脂肪酸總量和支鏈揮發性脂肪酸濃度與纈氨酸添加水平表現為顯著線性和二次曲線效應（P＜0.05）。除乙酸、異戊酸及乙酸與丙酸比值外，丙酸、丁酸、異丁酸和戊酸濃度隨纈氨酸水平的增加表現為顯著線性效應（P＜0.05）。纈氨酸添加水平對干物質和中性洗滌纖維體外降解量均無顯著影響（P＞ 0.05）。

2.2 亮氨酸對小麥秸稈體外發酵性能的影響由表2可知，隨著亮氨酸水平的升高，pH有顯著升高趨勢（P=0.06），同時氨氮和支鏈揮發性脂肪酸濃度表現為顯著線性升高（P＜0.05），而揮發性脂肪酸總量表現為顯著二次曲線效應（P＜0.05）。乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸濃度隨亮氨酸水平的升高表現為顯著線性和二次曲線效應（P＜0.05），而戊酸和乙酸與丙酸比值表現為顯著二次曲線效應（P＜0.05），異戊酸表現為顯著線性升高效應（P＜0.05）。亮氨酸添加水平對干物質和有機物體外降解量均無顯著影響（P＞0.05）。

表1 纈氨酸對小麥秸稈體外發酵性能的影響

表2 亮氨酸對小麥秸稈體外發酵性能的影響

2.3 異亮氨酸對小麥秸稈體外發酵性能的影響由表3可知，pH和揮發性脂肪酸總量隨異亮氨酸水平的升高表現為顯著線性和二次曲線效應（P＜0.05），而支鏈揮發性脂肪酸濃度表現為顯著線性升高（P＜0.05）。異亮氨酸添加水平對氨氮濃度無顯著影響（P＞0.05）。隨著異亮氨酸添加水平的升高，乙酸、丙酸、異戊酸及乙酸與丙酸比值均表現為顯著線性降低（P＜0.05），而丁酸、異丁酸和異戊酸濃度表現為顯著線性和二次曲線效應（P＜0.05）。戊酸濃度不受異亮氨酸添加水平的影響（P＞0.05）。隨著異亮氨酸添加水平的升高，干物質和中性洗滌纖維體外降解量有顯著降低的趨勢（P=0.08，P=0.07）。

表3 異亮氨酸對小麥秸稈體外發酵性能的影響

3 討論

Wang等（2008）研究發現，當所有支鏈氨基酸從發酵培養基中去除后，瘤胃細菌和原生動物的生長受到抑制，微生物蛋白產量下降44.52%，說明支鏈氨基酸是瘤胃微生物生長所必需的氨基酸。與其他氨基酸相比，瘤胃微生物更難合成亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸，因此，考慮到纖維素分解菌的生長和日糧結構碳水化合物的降解，有必要向飼喂牧草的反芻動物提供支鏈氨基酸。在本研究中，低濃度（1 mmol/L）纈氨酸和異亮氨酸提高了小麥秸稈中性洗滌纖維的降解性，這與Yang（2002）的研究結果一致。但當添加纈氨酸和異亮氨酸的濃度超過1 mmol/L時，小麥秸稈的干物質和中性洗滌纖維消化率有下降趨勢，因此，瘤胃微生物體外纖維的最佳濃度約為1 mmol/L。

添加支鏈氨基酸對瘤胃體外發酵的影響尚不清楚，在本研究中，通過補充纈氨酸或異亮氨酸，揮發性脂肪酸總量、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸的濃度增加，這與Zain等（2008）的研究結果一致。揮發性脂肪酸的增加是由于底物降解加速和支鏈氨基酸代謝增加所致。亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸在瘤胃內被厭氧細菌廣泛代謝，產生大量的異戊酸、2-甲基丁酸和異丁酸，這3種支鏈揮發性脂肪酸是瘤胃中大多數纖維降解微生物的必需生長因子（馮仰廉，2004）。在本研究中，支鏈揮發性脂肪酸產量隨支鏈氨基酸添加量的增加而線性增加。添加支鏈氨基酸增加了揮發性脂肪酸的總濃度，但最終的pH保持不變。

人們一直認為，纖維素分解瘤胃細菌利用氨作為唯一的氮源。但越來越多的研究與這一結論并不一致（Atasoglu等，2001），其發現苯丙氨酸對產琥珀酸菌基因的生長至關重要。到目前為止，還沒有關于個別種類的纖維素分解細菌對支鏈氨基酸有特殊偏好的報告。本研究發現，添加低水平的支鏈氨基酸對中性洗滌纖維的降解有有益影響。但還需進一步的純培養試驗來確定支鏈氨基酸在不同種類的纖維素分解細菌中的偏好和需求。

4 結論

添加低濃度（1 mmo/L）的纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸，可使小麥秸稈的體外發酵產生較高的揮發性脂肪酸。但還需進一步的體內試驗來探討支鏈氨基酸作為提高反芻動物飼料利用率的添加效果。