Ki-67在肺非典型腺瘤樣增生、原位腺癌、微浸潤(rùn)性腺癌及浸潤(rùn)性腺癌中的表達(dá)差異

胡文鏵 吳愛兵 李媛媛 謝健龍 王永存▲

1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，廣東湛江 524000；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東湛江524000；3.廣東省農(nóng)墾中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科五區(qū)，廣東湛江 524002；4.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科，廣東湛江524000

肺癌為當(dāng)前臨床中發(fā)生率最高的惡性腫瘤，我國每年約有1090萬新確診癌癥，其中有135萬例屬于肺癌，而且病死率也居于癌癥的首位[1]。其中，肺腺癌為肺癌常見的一種病理類型，主要是指來源于支氣管黏膜上皮細(xì)胞的肺部癌灶。有研究指出[2]，肺腺癌患者即使病理分期、治療手段相同，其復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率也會(huì)有顯著的差異，而尋找此種差異出現(xiàn)的原因，能夠有助于臨床客觀地判斷患者的預(yù)后。因此，積極尋找獨(dú)特的預(yù)后評(píng)估因子對(duì)于指導(dǎo)臨床治療具有重要的意義。細(xì)胞核相關(guān)抗原Ki-67是一種目前應(yīng)用最廣泛的增殖細(xì)胞標(biāo)志物[3]。相關(guān)研究報(bào)道[4]，Ki-67作為一種核增殖抗原，其在肺癌中的研究有著廣闊的前景，特別是在肺癌早期診斷、靶向治療及其預(yù)后判斷都有很高價(jià)值?，F(xiàn)為進(jìn)一步探討Ki-67在肺不典型腺瘤樣增生、原位腺癌、微浸潤(rùn)性腺癌、浸潤(rùn)性腺癌中的表達(dá)差異及其與臨床病理因素的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

按照2011年國際肺腺癌研究學(xué)會(huì)（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）等公布的多學(xué)科肺腺癌新分類[5]，選取2010年1月～2019年1月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、農(nóng)墾中心醫(yī)院確診的93例癌前病變/肺腺癌患者進(jìn)行研究，18例肺非典型腺瘤樣增生患者中男9例，女9例，年齡51～85歲，平均（66.0±11.0）歲；25例原位腺癌患者中男12例，女13例，年齡49～82歲，平均（66.5±10.5）歲；22例微浸潤(rùn)性腺癌患者中男14例，女8例，年齡52～84歲，平均（67.0±10.0）歲；28例浸潤(rùn)性腺癌患者中男17例，女11例，年齡46～80歲，平均（66.0±11.0）歲，四種病理類型的年齡、性別資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）首次診斷，且經(jīng)病理復(fù)檢確診；（2）臨床資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往有肺部手術(shù)史；（2）診斷不明；（3）納入研究時(shí)伴有嚴(yán)重感染性疾病。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 DAB顯色試劑（編號(hào)002941，美國Dako公司）；大鼠抗人Ki67單克隆抗體（貨號(hào) 00006140，克 隆 號(hào) MIB-1，Dako公 司）；Dako autostainer link48自動(dòng)組織染色機(jī)購自丹麥Dako公司；OLYMPUS CX22雙目顯微鏡。

1.2.2 標(biāo)本采集 均在手術(shù)后取適量肺部病變組織作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，取材后將其置于10%中性福爾馬林溶液中固定，并予以石蠟包埋，制作成厚度為4μm的連續(xù)切片。

1.2.3 檢測(cè)方法 （1）根據(jù)1∶50比例配制好抗原修復(fù)液，置于全自動(dòng)免疫組化預(yù)處理系統(tǒng)中進(jìn)行預(yù)處理，將其加熱到65℃，隨后把切片置于抗原修復(fù)液中；（2）將抗原修復(fù)液加熱到95℃，時(shí)間20min，隨后降溫至65℃，取出切片置于洗脫緩沖液浸泡5min；（3）將切片置于組織染色機(jī)上進(jìn)行染色，并加入適量過氧化物酶阻斷劑，5min后用洗脫緩沖液沖洗；（4）滴加一抗→二抗，并用洗脫緩沖液沖洗，然后用DAB顯色劑顯色→蘇木素染色液復(fù)染；（5）將切片置于70%酒精→80%酒精→90%酒精→100%酒精→100%酒精中各2min，隨后重復(fù)進(jìn)行2次二甲苯透明5min，封片。在顯微鏡下觀察、統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。與此同時(shí)，選擇PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.4 結(jié)果判定[6]若細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色或深棕黃色顆?？膳袛酁殛栃员磉_(dá)，每個(gè)標(biāo)本切片在光鏡高倍視野（×400）下選5個(gè)細(xì)胞增殖較為旺盛的視野計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)，每個(gè)視野的陽性細(xì)胞百分比=陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）比較不典型腺瘤樣增生、原位腺癌、微浸潤(rùn)腺癌、浸潤(rùn)性腺癌肺組織中Ki-67表達(dá)差異；（2）比較不同分化程度、侵襲轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度中Ki-67表達(dá)差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料Ki-67表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)描述采用（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較應(yīng)用方差分析，兩兩比較比較采用LSD-t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同病理類型Ki-67表達(dá)水平差異

Ki-67在肺非典型腺瘤樣增生、原位腺癌、微浸潤(rùn)性腺癌及浸潤(rùn)性腺癌中的表達(dá)水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同病理類型Ki-67表達(dá)水平差異

2.2 肺浸潤(rùn)性腺癌中Ki-67表達(dá)與相關(guān)臨床病理因素的關(guān)系

本研究28例肺浸潤(rùn)性腺癌患者中，不同組織學(xué)分級(jí)之間的Ki-67表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但Ki-67表達(dá)在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移不同程度中的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見表2。而且經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，Ki-67表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、侵襲轉(zhuǎn)移程度均無相關(guān)性（r=0.052，P=0.792；r=0.098，P=0.542），但與組織學(xué)分級(jí)呈顯著的負(fù)相關(guān)（r=-0.527，P=0.004）。

表2 肺浸潤(rùn)性腺癌中Ki-67表達(dá)與相關(guān)臨床病理因素的關(guān)系

3 討論

隨著空氣環(huán)境污染的加重以及吸煙人數(shù)的逐年升高，肺癌成為我國第一大癌癥，而且由于肺癌的早期表現(xiàn)不明顯，在臨床首次確診病例中有80%已發(fā)展為晚期[7]。目前，肺腺癌發(fā)病率不斷攀升，已經(jīng)超過肺鱗狀細(xì)胞癌，肺腺癌的精準(zhǔn)化治療越發(fā)重要，而精準(zhǔn)化治療的堅(jiān)強(qiáng)后盾即需精準(zhǔn)化的病理診斷。其中，Ki-67為當(dāng)前臨床中較為常用的一項(xiàng)腫瘤檢測(cè)指標(biāo)，有學(xué)者[8-9]認(rèn)為，按照WHO提出的肺腺癌多學(xué)科分類的內(nèi)容和新標(biāo)準(zhǔn)，探討Ki-67在肺腺癌組織中的表達(dá)情況及相關(guān)性有助于臨床更清楚地了解肺腺癌的生物學(xué)行為，進(jìn)而為疾病診治以及預(yù)后評(píng)估提供相關(guān)參考依據(jù)。

Ki-67最早是在霍奇金淋巴瘤小鼠的免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的，將其納入到單克隆抗體范疇。而隨著對(duì)其研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Ki-67的分子結(jié)構(gòu)由分子量分別為395KD、345KD的兩條多肽鏈所組成，屬于一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核蛋白，且其生物功能與RNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)，故有學(xué)者[10]提出，Ki-67活性降低可以抑制核糖核酸RNA合成。近年，Ki-67蛋白活性已成為各種惡性腫瘤研究的熱門生物指標(biāo)之一，主要是通過檢測(cè)病變組織Ki-67陽性表達(dá)水平來了解其癌細(xì)胞增殖活性[11]。當(dāng)前臨床，免疫組化檢測(cè)方法是了解Ki-67蛋白表達(dá)情況繼而用以評(píng)估癌細(xì)胞增殖程度最可靠的手段[12]。牛聰?shù)萚13]采用免疫組化手段對(duì)比肺癌組織、癌旁組織、肺部良性病變組織中Ki-67陽性表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌組織的Ki-67樣本表達(dá)顯著升高。張連美等[14]研究也顯示，非小細(xì)胞肺癌組織的Ki-67陽性表達(dá)率較癌旁組織要高，且表達(dá)高低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM臨床分期密切相關(guān)，而與癌灶大小、位置等無相關(guān)性。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，Ki-67在非典型腺瘤樣增生、原位腺癌、微浸潤(rùn)性腺癌及浸潤(rùn)性腺癌組織中的表達(dá)水平逐漸升高，提示Ki-67高表達(dá)時(shí)能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞異常增殖。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Ki-67表達(dá)水平與組織學(xué)分級(jí)有顯著的相關(guān)性（P＜0.05），但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移無明顯的相關(guān)性（P＞0.05），提示Ki-67表達(dá)與肺腺癌的增值生長(zhǎng)程度有著正相關(guān)性，故檢測(cè)該指標(biāo)有助于輔助預(yù)測(cè)肺腺癌的生物學(xué)行為，為患者的預(yù)后判斷提供參考依據(jù)。但本研究結(jié)果與韓義明等[15]研究不同，其提出Ki-67表達(dá)與肺腺癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，筆者推測(cè)這有可能與樣本量大小、地區(qū)差異等有關(guān)。

綜上所述，Ki-67高表達(dá)為肺腺癌發(fā)生的主要分子事件，可參與腫瘤發(fā)展，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)行大樣本、多中心、多因素分析。