幽門螺桿菌感染對慢性淺表性胃炎患者胃內菌群的影響

劉穎 許文俠 黃彩群 王華斌

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種鏡下呈螺旋狀或短桿狀的革蘭陰性菌。在Hp發現之前，人們一直認為胃內是無菌環境，因為高胃酸環境能抑制來自口腔的微生物生長，但Hp的發現改變了這種觀念。事實上胃內的菌群比想象中要復雜多樣化。有數據顯示胃內微生物密度為10～103CFU/g[1]。Hp是消化性潰瘍、胃癌和黏膜相關性淋巴組織瘤的重要病原菌，WHO組織國際癌癥研究機構將其確定為Ⅰ類致癌因子。據統計全球有超過50%的人感染Hp。流行病學調查結果顯示，我國成人中Hp感染率達到40%～60%[2]。Hp的致病機制目前尚不明確，但越來越多的研究顯示，胃部疾病的發生發展是環境、宿主和細菌等多種因素共同作用的結果。Hp作為胃內重要的致病菌，是否對胃內菌群的結構和豐度有影響？基于此，本研究選取了慢性淺表性胃炎患者的胃黏膜組織標本，通過高通量測序技術檢測16S rRNA基因序列，獲得胃內菌群的結構和豐度，探討Hp感染對胃內菌群的影響，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年10月至2018年6月金華市中心醫院收治的因胃部不適行胃鏡檢查的患者38例，納入標準：患者胃鏡檢查前4周內未使用過抗生素、抑酸制劑、鉍劑等影響胃內菌群的藥物；未接受過胃腸手術?；颊呔羧∥葛つそM織標本，經病理學檢查均診斷為慢性淺表性胃炎?；颊呶葛つそM織病理學檢查和細菌培養結果中任一項為Hp陽性，則歸為Hp陽性組（Hp-P組）；兩者都為陰性，則歸為Hp陰性組（Hp-N組）[3-4]。Hp-P組患者14例，其中男8例，女6例，年齡（45.07±9.72）歲；Hp-N組患者24例，其中男9例，女15例，年齡（51.71±10.45）歲。兩組患者性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 哥倫比亞血平板（法國梅里埃公司）；微需氧袋（法國梅里埃公司）；腦心浸出液（英國Oxoid公司）；QIAamp?DNA Mini Kit（德國QIAGEN公司）；2×Phanta Max Master Mix（南京諾唯贊公司）；VAHTS DNA Clean Beads（南京諾唯贊公司）；Qubit dsDNA HS Assay Ki（t美國ThermoFisher公司）；kapa library quantification Ki（t美國KAPA Biosystems公司）；Phix Control V3（美國Illumina公司）；MiSeq Reagent Kit v3（美國Illumina公司）。DNP-9022恒溫培養箱（上海精宏公司）；G8800A 型PCR儀（美國Aglient公司）；QPCR儀（瑞士Roche公司）；Miseq型NGS測序儀（美國Illumina公司）。

1.2.2 標本采集 胃鏡下分別鉗取患者胃竇黏膜組織3塊，大小1 mm×2 mm。1塊做病理學檢查，1塊做細菌培養，1塊置于無菌凍存管中，于-80℃環境保存。

1.2.3 基因組DNA提取和16S rRNA擴增子測序 胃黏膜組織中加入0.9%氯化鈉溶液200 μl，用組織研磨棒將組織研磨成勻漿，使用QIAamp?DNA Mini Kit提取總DNA，參照產品說明書操作。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和純度。16S rRNAV3～V4區進行擴增。引物序列：PF（5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和 RF（5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）。反應體系（25 μl）：2×Phanta Max Master Mix 12.5 μl，上下游引物（10 μmon/L）各 1 μl，DNA 1 μl，ddH2O 9.5 μl。反應條件：95 ℃ 3min；25次循環 95℃ 30 s，55℃ 30s,72℃ 45s;72℃ 5min。PCR產物質檢及純化后片段大小應為550 bp左右。將純化后的PCR產物進行添加特異性標簽序列PCR（Index PCR）構建PCR文庫，對PCR文庫進行純化和質檢，16s V3～V4文庫片段大小應為630 bp左右。對質檢和定量合格的文庫上機測序，測序平臺為Illumina Miseq。

1.2.4 測序數據處理用軟件cutadapt（v1.11）將原始數據PE（paired-end）去引物，以確保數據是目標片段。用軟件 pandaseq（v2.9）將不含引物 PE（paired-end）序列拼接成長tags。對拼接長tags進行質控（python3腳本）：去除低質量序列（平均質量值低于Q20，含有模糊堿基N）；去除長度在300～480 bp以外的序列。用軟件vsearch（v2.4.1_linux_x86_64）對高質量長序列進行去嵌合體。對去除嵌合體的高質量數據按相似度0.97進行OTU聚類，挑選代表序列。使用rdp-classifier（v2.11）對代表序列進行物種注釋。使用qiime流程得到OTU豐度表和物種豐度表。

1.3 觀察指標 采用稀釋曲線反映測序數據的合理性。胃內菌群的豐度和多樣性采用α多樣性分析，用指數Chao1、Shannon和Simpson來描述。胃內菌群之間的物種組成相似性的分析用PCoA來描述，采用ANOSIM分析。PCoA是一種研究數據相似性或差異性的可視化方法，通過一系列的特征值和特征向量進行排序后，選擇主要排在前幾位的特征值。PCoA可以找到距離矩陣中最主要的坐標，結果是數據矩陣的一個旋轉，它沒有改變樣品點之間的相互位置關系，只是改變了坐標系統，通過PCoA可以觀察個體或群體間的差異。采用相關性三角熱圖分析Hp-P組患者胃內菌群相關性。

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數資料組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hp-P組與Hp-N組患者胃內菌群豐度和多樣性比較 由稀釋曲線可見，Hp-P組患者胃內細菌物種的豐度明顯低于Hp-N組，見圖1。α多樣性分析可見，Hp-P組和Hp-N組的Shannon指數分別為（0.97±0.78）和（5.36±0.76），Simpson 指數分別為（0.19±0.17）和（0.93±0.06），Chao1 指數分別為（287.21±70.66）和（646.92±156.07）。Hp-P組與Hp-N組患者胃內菌群多樣性上差異有統計學意義（均P＜0.05），Hp-P組患者胃內菌群的多樣性明顯低于Hp-N組。

圖1 Hp-P組與Hp-N組患者胃內菌群稀釋曲線

2.2 Hp-P組與Hp-N組患者胃內菌群結構相似性分析 PCoA分析結果顯示，Hp-P組和Hp-N患者胃內菌群明顯聚集在兩個不同的區域。ANOSIM分析結果顯示，R=0.988，P=0.001，Hp-P組與 Hp-N 組差異有統計學意義。見圖2（插頁）。這說明Hp-P組與Hp-N組患者胃內菌群結構相似性較高，而兩組之間菌群結構存在明顯差異。

2.3 Hp-P組與Hp-N組患者胃內菌群組成分析 在門水平，Hp-N組相對豐度＞1%的優勢物種分別為Proteobacteria（30.26%）、Bacteroidetes（27.56%）、Firmicutes（24.61%）、Actinobacteria（5.2%）、Fusobacteria（4.6%）、Unknown;Other（3.0%）、k__Bacteria;Other（2.7%）；Hp-P組相對豐度＞1%的優勢物種分別為Proteobacteria（93.7%）、Bacteroidetes（2.5%）、Firmicutes（1.9%）。在屬水平，Hp-N組相對豐度＞1%的優勢物種分別為Prevotella（14.5%）、Streptococcus（10.1%）、Neisseria（7.1%）、Haemophilus（6.5%）、Sphingomonas（4.6%）、Veillonella（4.6%）、Methylobacterium（4.6%）、Porphpyromonas（3.5%）、Fusobacterium（3.1%）、Rothia（2.5%）、Gemella（1.8%）、Granulicatella（1.3%）、Leptotrichia（1.2%）、Bacteroides（1.2%）、Actinomyces（1.1%）；Hp-P組相對豐度＞1%的優勢物種分別為Helicobacter（89.1%）、Prevotella（1.2%）、Methylobacterium（1.1%）、Sphingomonas（1.1%）。見圖 3（插頁）。

兩組間物種相似性分析，在門水平，Hp-P組Proteobacteria明顯高于Hp-N組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Bacteroidetes、Firmicutes、Actinobacteria、Fusobacteria在Hp-N組中明顯高于Hp-P組，差異有統計學意義（P＜0.05）。在屬水平，Hp-N和Hp-P兩組物種差異比較，Hp-N 組Prevotella、Streptococcus、Neisseria、Haemophilus、Sphingomonas明顯高于Hp-P組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4（插頁）。

Hp-P和Hp-N兩組菌落結構相似性分析結果說顯示，Hp-N 組的優勢菌為：Prevotella（14.5%）、Streptococcus（10.1%）、Neisseria（7.1%）、Haemophilus（6.5%）；Hp-P組的優勢菌為Helicobacter（89.1%）。

圖2 Hp-P組與Hp-N組患者胃內菌群差異性分析（a：PCoA分析；b：ANOSIM分析）

圖3 Hp-P組與Hp-N組患者胃內菌群組成分析（a：門水平；b：屬水平）

圖4 Hp-P組與Hp-N組患者胃內菌群比較柱狀圖（a：門水平；b：屬水平菌群）

2.3 Hp-P組患者胃內菌群相關性分析 通過分析物種在不同樣品的豐度變化一致性情況，推測Hp-P組患者胃內菌群之間的作用關系。相關性三角熱圖可看到Helicobacter與其他菌群呈負相關，說明當胃內有Hp定植后，會影響其他菌群在胃內的定植，使其他菌群在胃內定植減少，Hp成為唯一的優勢菌。

3 討論

自1983年Marshall和Warren醫生發現Hp后，人們改變了胃內是無菌環境的觀念[5]。隨著研究的深入，人們了解到胃內除了Hp以外還有其他細菌定植。以前對胃內菌群的研究多采用培養方法，但胃內細菌量少且很多細菌在體外難培養，因此限制了人們對胃內菌群的認識。16S rRNA基因是編碼原核生物核糖體小亞基的基因，長度約為1 542 bp，分子大小適中，突變率小，是細菌系統分類學研究中最常用和最有用的標志[6]。16S rRNA基因序列包括9個可變區和10個保守區，保守區序列反映了物種間的親緣關系，而可變區序列則能體現物種間的差異。因此通過檢測16S rRNA基因序列，人們能了解到研究樣品的物種分類、物種豐度以及系統進化。近幾年第二代高通量測序技術和生物信息學的發展，為16S rRNA基因檢測提供了有效的檢測手段。本研究選取了38例慢性胃炎患者，經病理學檢查診斷均為慢性淺表性胃炎。將其分為兩組，Hp-N組24例和Hp-P組14例，應用二代測序技術檢測16S rRNA基因序列，探討Hp感染對慢性淺表性胃炎患者胃內菌群的影響。研究結果顯示Hp陽性的慢性淺表性胃炎患者，胃內菌群的豐度和多樣性都明顯的低于Hp陰性的慢性淺表性胃炎患者。該結果與之前研究結果相符[7-8]。有研究顯示，Hp感染的兒童患者胃內菌群的豐度和多樣性同樣也明顯降低[9]。說明Hp感染無論在兒童還是成人都會明顯降低胃內菌群的豐度和多樣性。

胃內菌群結構分析，本研究結果顯示，在門水平Hp-N組的優勢菌群為Proteobacteria（30.26%）、Bacteroidetes（27.56%）、Firmicutes（24.61%）、Actinobacteria（5.20%）、Fusobacteria（4.56%），占菌群的 90%以上；在屬水平Hp-N組的優勢菌群為Prevotella（14.5%）、Streptococcus（10.1%）、Neisseria（7.1%）、Haemophilus（6.5%）、Sphingomonas（4.6%）、Veillonella（4.6%）、Methylobacterium（4.6%），占總菌群的50%。研究顯示，健康人群中胃內優勢菌群在門水平為Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria；在屬水平為Streptococcus[10-12]。該結果提示慢性淺表性胃炎患者胃內優勢菌群的結構與正常人群相似，但優勢菌群的豐度發生了變化。有研究指出，在胃癌高發地區，Hp陰性的胃炎組，在門水平的優勢菌群為Firmicutes、Fusobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria；在屬水平Hp陰性的胃炎組，明顯增高的菌群為Streptococcus sp和Haemophilus parainfluenzae[7]。說明不同地區慢性淺表性胃炎患者胃內優勢菌群的豐度有差異。本研究中Hp-N組豐度最高的是Prevotella。Prevotella是一種口腔內常見菌群，可引起牙周炎等感染性疾病。近年來，Prevotella被證實與炎癥反應密切相關，隨著Prevotella相對豐度升高，炎癥反應程度會加重[13]。Streptococcus和Neisseria在本研究中Hp-N組豐度也較高。多項研究顯示，Streptococcus感染與胃癌發生有關[14]。在Hp-P組Helicobacter是唯一優勢菌群，其他菌群的豐度都較Hp-N組降低。但有研究顯示，Prevotella、Fusobacterium、Nesseria、Veillonella的相對豐度在Hp陽性組明顯升高[8]。這可能與選擇的對照組和實驗組不同有關，該研究是以健康人群為對照組，以Hp陽性為實驗組，而未考慮胃部的疾病狀況。

Hp是胃癌的高危因素，但只有不到3%的Hp感染者會發展成胃癌，Hp根治并不能完全避免胃癌的發展。研究顯示在胃癌的發展過程中Hp的定植量逐漸減少，甚至消失，但胃癌組織菌群的豐度和多樣性卻明顯較癌旁明顯增加[15]。腸化生是胃癌發生的癌前病變，研究者發現Hp陰性的腸化生患者Rhizobiales增多，宏基因組分析觀察到腸化生患者的胃組織內T4SS基因增多，因此T4SS蛋白的高表達可能與胃癌的發生有關[16]。本研究結果顯示Hp感染會降低慢性淺表性胃炎患者胃內菌群的結構和豐度，但未探討Hp感染對癌前病變腸化生階段胃內菌群的影響，也未能進一步探討Hp導致胃癌的作用機制。這啟發了筆者今后的研究方向。