HPLC法測定補腎養骨口服液中淫羊藿苷的含量

王汝山

廣東省陽江市中醫醫院，廣東 陽江 529500

補腎養骨口服液為本院的院內制劑，由淫羊藿、續斷、牛大力等四味中藥飲片制成，具有補腎壯陽、強筋健骨功效，用于老年性骨質疏松癥以及腎虛體倦、四肢麻木、腰膝酸痛、性欲減退等癥。本制劑原質量標準偏低，僅有薄層鑒別、pH值、相對密度和微生物限度檢驗項目，缺少能評價制劑質量好壞的關鍵指標。為了確保制劑臨床療效，本實驗對補腎養骨口服液的君藥淫羊藿開展含量測定，以淫羊藿苷作為質量指標成分[1]，建立了淫羊藿苷的高效液相色譜測定方法，結果表明該方法能準確檢測補腎養骨口服液中淫羊藿苷含量，達到可用于本制劑質量控制的目的。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀；AB 135-S電子天平(梅特勒-托利多)；AB204-N型天平(梅特勒-托利多)；超純水機(北京歷元電子儀器)；SB25-12DTD數控超聲清洗器。

1.2 材料 補腎養骨口服液(醫院自制，包裝規格：10 mL×10支/盒，批號：20190801、20190802、20190901、20190902、20191001、20191002)；淫羊藿苷對照品(含量以94.2%計，批號：110737-201516，中國食品藥品檢定研究所)；乙腈和甲醇均為色譜純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(26∶74)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

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2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品16.5 mg，置100 mL量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含淫羊藿苷0.165 mg的對照品貯備溶液。精密量取對照品貯備溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含淫羊藿苷0.0495 mg的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取本品6 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇振搖5 min，放冷，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取缺淫羊藿的陰性制劑6 mL，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗 按照“2.1”項下色譜條件，分別測定對照品溶液、供試品溶液與缺淫羊藿的陰性樣品溶液，記錄色譜圖，結果在供試品色譜圖中，在與淫羊藿苷對照品溶液色譜圖相應保留時間處有相應的淫羊藿苷峰出現，而陰性對照無干擾，表明具有良好專屬性，色譜圖如圖1所示。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取對照品貯備溶液1、2、3、4、5 mL，置10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋制成含淫羊藿苷質量濃度分別為0.0165、0.0330、0.0495、0.0660、0.0825 mg/mL 的系列對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，分別進樣10 μL，以峰面積為縱坐標(Y)，以質量濃度(mg/mL)為橫坐標(X)進行線性回歸，得到線性方程為Y=21905X-0.9030，r=0.9997，表明淫羊藿苷在0.0165 ～0.0825 mg/mL范圍內的線性關系良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，連續重復進樣6次，每次進樣量為10 μL，分別測定并計算，結果淫羊藿苷峰面積的RSD值為1.25%(n=6)，表明本法精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于第0、1、2、4、8 h取樣，進樣量為10 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算出淫羊藿苷峰面積的RSD值為1.45%(n=5)，表明在8 h內供試品溶液具有良好的穩定性。

2.7 重復性試驗 分別取6份同一批號樣品，按“2.2.2”項下制備方法制備6份供試品溶液，分別測定，樣品含量測定的RSD值為0.02%(n=6)。

2.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量為0.445 mg/mL的本品溶液3 mL,共6份，分別精密加入淫羊藿苷對照品貯備溶液7 mL(0.165 mg/mL)，搖勻，按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別測定，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.9 樣品含量測定 取不同批號的本品6批，按“2.2.2”項下制備方法制成供試品溶液，分別進樣10 μl，測定淫羊藿苷含量，6批樣品的平均含量為0.44 mg/mL，見表2?？紤]到生產中原料飲片的產地、采收與加工以及制劑生產工藝條件存在偏差等因素的影響，實際生產不同批次的制劑含量測定結果存在波動，故取含量均值的80%作為含量測定標準的下限，規定本品每1 mL含淫羊藿以淫羊藿苷計，不得少于0.35 mg，作為本制劑HPLC法含量測定的內控標準。

表2 樣品中淫羊藿苷含量測定結果 (n=6)

3 討論

本實驗參考文獻[2～4]考察了3種比例的乙腈-水(體積比分別為26∶74、27∶73、30∶70)和2種比例的甲醇-水(體積比分別為63∶37、65∶35)作為流動相的分離效果，結果發現采用乙腈-水(26∶74)時，樣品中的淫羊藿苷能較好與其它組分達到基線分離，此時色譜峰出峰時間適宜，峰型尖銳對稱。

由于補腎養骨口服液中的淫羊藿苷在貯存過程會存在水解，經過對本制劑1年穩定性考察結果發現，含量測定結果均符合內控標準的規定，表明所建立的HPLC法可用于補腎養骨口服液質量控制，亦可為補腎養骨口服液質量標準修訂提供依據。