稻曲病菌菌株GZ-2中攜帶的病毒基因組特征

張婷婷， 滕 麗， 蔡小姚， 劉紅美*

(1.貴州醫科大學 生物與醫學工程重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫科大學 環境污染與疾病監控省部共建教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫科大學 基礎醫學院， 貴州 貴陽 550025)

真菌病毒(mycovirus或Fungal viruses)是一類感染絲狀真菌、蘑菇和酵母并在寄主體內復制與增殖的病毒。1953年，Shope最早在繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)中分離得到一種可誘導哺乳動物合成干擾素提高動物抗病毒能力的物質，稱為“Helenine”。1962年，真菌病毒被首次報道，英國科學家HOLLINGS[1]在發病的雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)子實體中發現了球形病毒和短棒狀病毒的病毒粒體，通過分離病毒粒體接種到健康的蘑菇，呈現了病害傳播的過程，這標志了真菌病毒學的開端。病毒基因組的核酸類型和病毒基因的復制方式是真菌病毒分類的主要依據，目前發現的絕大多數真菌病毒的基因組核酸是雙鏈核糖核酸(double-stranded RNA，dsRNA)。dsRNA病毒主要屬于6個科，分別是呼腸孤病毒科(Reoviridae)、全病毒科(Totiviridae)、雙分病毒科(Paritiviridae)、產黃青霉病毒科(Chrysoviridae)、四分體病毒科(Quadriviridae)和巨型雙節段病毒科(Megabirnaviridae)[2]。然而，近年來越來越多的dsRNA被證明尚未分類[3-5]。

水稻稻曲病(Rice false smut)是由稻曲病菌(有性態：Villosiclavavirens；無性態：Ustilaginoideavirens)侵染造成的一種水稻穗部真菌類病害，病原菌侵染導致水稻小花上形成體積數倍于稻粒的病原菌菌落，即稻曲球[6-7]。近20年來，由于中國水稻肥水施用水平的普遍提高和大穗型品種的大面積推廣，稻曲病的發生呈加重趨勢，由一個歷史上零星、偶發性病害演變成為中國各水稻產區的主要病害之一[8-9]。稻曲病的發生不但對水稻高產穩產造成威脅，同時由于稻曲病菌能夠產生大量毒素(Ustiloxins)，對人、動物和植物的細胞分裂具有強烈的抑制作用[10-13]，用稻曲病粒拌飼料喂家兔和當地母雞，經35～84 d喂養，可引起死亡和內臟器官病變，用帶稻曲菌的谷糠喂豬，母豬出現產死胎、干尸胎和畸形胎等癥狀[8]。因此，對稻米的食用安全和稻田周邊食草動物帶來潛在的威脅。

2010年代，ZHANG等[14]首次報道了水稻稻曲病菌菌株中攜帶真菌病毒，關于稻曲病菌中攜帶真菌病毒報道隨之增加[5，15-18]。而筆者從稻曲病菌菌株GZ-2中分離的真菌病毒，病毒命名為UstilaginoideavirensUnclassified virus 2(UvUV2)。對UvUV2的全基因組序列測序和分析，發現UvUV2尚未被分類。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 稻曲病菌菌株GZ-2于2015年從貴州省稻曲病菌侵染的水稻稻曲球中分離。

1.1.2 試劑 氨芐青霉素(Ampicillin；Amp)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，DNA膠回收試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，2×PCR mix購自北京康潤誠業生物科技有限公司，DH5α感受態細胞購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司，DNase I酶、S1 Nuclease酶、M-MLV反轉錄酶、Klenow酶、pMD18-T載體、T4RNA連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 儀器與設備 制冰機、電冰箱、電泳儀、培養箱、恒溫振蕩器、凝膠成像儀、恒溫水浴鍋、高速離心機、超凈實驗工作臺等。

1.2 稻曲病菌菌株GZ-2的分離

將稻曲球切分成小塊，用5%的次氯酸鈉將新鮮的稻曲球進行表面消毒1 min，用無菌蒸餾水浸泡3次，隨后用75%的酒精表面消毒1 min左右，再用無菌蒸餾水浸泡3次，然后置于無菌離心管中震蕩制備成稻曲病菌厚垣孢子的懸浮液，并用無菌蒸餾水將厚垣孢子懸浮液稀釋成10倍梯度的孢子液，用移液槍吸取100 μL不同梯度的孢子液，分別涂布于含有100 μg/mL頭孢霉素的土豆葡萄糖培養基(Potato Dextrose Agar，PDA)上，置于28℃恒溫培養箱中培養，逐日觀察分離結果，待長出菌落后，挑取單個菌落。對所有成功分離獲得的菌株進行編號，保存于-20℃冰箱中。

1.3 dsRNA的提取及純化

挑取目標菌株GZ-2，在PDA培養基上培養7～10 d。將菌株GZ-2的菌絲體在液氮冷凍條件下用碾缽研磨成粉末狀，裝入無菌離心管中。每0.4 g樣品中依次加入600 μL 2×GPS、600 μL苯酚(Tris-HCl飽和，pH 8.0)、600 μL氯仿-異戊醇(體積比24∶1)和138 μL 10% SDS，劇烈振蕩，使之充分混勻，12 000 r/min、4℃離心10 min。然后取上清液約600 μL，加入0.04 g CF-11纖維素粉末和114 μL無水乙醇，混勻后4℃過夜。然后離心機12 000 r/min離心5 min后棄上清液，倒扣濾紙上吸干殘液，移液器加入600 μL清洗緩沖液，混勻后靜置1 min；重復洗脫3次后，加入640 μL 1×STE，混合搖勻，12 000 r/min離心8 min并吸取600 μL上清液至新的無菌離心管中，然后取上清液600 μL緩慢移入管中，加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉，加入1倍體積的異丙醇，充分混勻后于-20℃冰箱中靜置2 h，12 000 r/min、4℃離心30 min，去除上清液，加入500 μL 75%乙醇，振蕩無菌離心管，將沉淀彈起，清洗沉淀，12 000 r/min 4℃離心5 min后棄去上清液，用移液槍吸去管底的多余液體，風干沉淀10 min，加入20 μL DEPC-H2O，沉淀溶解完全得到菌株GZ-2中的真菌病毒。用DAaseI(RNase free)和S1核酸酶處理樣品，去除樣品中的DNA和單鏈RNA(single-stranded RNA，ssRNA)污染。樣品在1%瓊脂糖凝膠中電泳，用0.1 μg/mL溴化乙錠染色，紫外下觀察UvUV2的條帶特征。

1.4 cDNA合成及分子克隆

將純化的dsRNA樣品作為模板，采用FROUSSARD[19]描述的隨機引物擴增法獲得了UvUV2的隨機序列。病毒末端克隆的方法參考POTGIETER等[20]采用的方法，首先在dsRNA的兩末端加1段已知序列的接頭片段，然后將加上接頭的dsRNA進行反轉錄合成cDNA第1條鏈，最后用與該序列互補的一段寡核苷酸作為引物，另一引物根據已測定序列設計，進行逆轉錄-聚合酶鏈反應(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction；RT-PCR)獲取dsRNA末端的序列。將擴增的cDNA產物與pMD18-T載體連接，并熱激轉化大腸桿菌DH5α，鑒定陽性克隆，進行測序分析。

1.5 序列拼接及系統進化分析

測序得到的序列被組裝并上傳GenBank數據庫中，獲取的登錄號為MH094804。序列拼接、分析和比對使用DNAMAN 7.0和COBALT web服務器(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi?link_loc=BlastHomeLink)；序列同源性搜索使用NCBI網站的在線BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。利用最大相似性法則(maximum-likelihood，ML)進行系統進化樹的構建。ML樹的計算使用MEGA 5.0軟件[21]。

2 結果與分析

2.1 UvUV2的條帶類型

水稻稻曲病菌株GZ-2中提取的真菌病毒，經DNaseI和S1核酸酶處理，在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見到在3 kbp附近有1條單一的明顯的dsRNA條帶(圖 1)，命名為UstilaginoideavirensUnclassified virus 2(UvUV2)。

2.2 UvUV2中間序列的獲取

菌株GZ-2攜帶的dsRNA經反轉錄、擴增得到大量隨機片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈彌散條帶(圖2)。切下750～1 000 bp的隨機片段進行膠回收、連接、克隆，挑選單克隆進行PCR鑒定，結果在1%瓊脂糖凝膠上呈大小不一的單一片段(圖3)。挑取較大的隨機片段進行測序、拼接。

2.3 UvUV2末端序列的獲取

UvUV2兩末端非編碼區結構復雜，不能通過隨機片段擴增得到，需在獲得UvUV2中間序列的基礎上在2個末端加上1個接頭引物后反轉錄成cDNA，另一端再用基于已獲取的UvUV2片段，設計特異引物進行PCR擴增才能得到末端序列。擴增得到的末端序列通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，部分結果如圖4所示。將目的片段切膠回收經過連接、轉化、測序等步驟獲得序列。

2.4 UvUV2序列

如圖5所示，UvUV2全長2 887 bp，G+C含量為58.8%。通過隨機引物擴增法得到UvUV2的隨機片段(圖5中1～16)，經過DNAMAN 7.0軟件進行序列拼接，發現并不能完全拼接出1條完整的全基因序列。隨后，根據已獲取的基因組序列設計特異性的搭橋引物A和B，通過PCR克隆出未獲得的基因組序列，用Potgieter等描述的方法擴增5′和3′末端[22]。最后通過DNAMAN 7.0軟件拼接得到1條完整的UvUV2基因組序列。

2.5 UvUV2的全基因組序列

由圖6可見，UvUV2含有2個開放閱讀框(ORF1和ORF2)。ORF1起始于第10位堿基，終止于第571位的UAG密碼子，全長561 bp，編碼186個氨基酸(20.06 kDa)；ORF2起始于第431位的AGU密碼子，終止于第2 825位堿基，全長2 394 bp，編碼797個氨基酸(89.42 kDa)。5′和3′末端非翻譯區分別長10 bp和62 bp。通過BlastP比對分析顯示，ORF1編碼未知蛋白；ORF2編碼依賴于RNA的RNA聚合酶(RdRp)。2個ORF框重疊340 bp，ORF2可能以融合蛋白的形式與ORF1一起通過+1核糖體移碼機制表達。在UvUV2中發現基因組序列(CCC_UUU_UAG563-571)類似于甲型流感病毒基因組中的滑動序列(UCC_UUU_CGU)，通過+1核糖體移碼促進融合蛋白的表達(圖7)。因此，ORF1和ORF2的融合將產生分子量為104.3 kDa的Gag-Pol融合蛋白。

2.6 系統進化樹構建

由圖8可見， 22株dsRNA病毒科成員UvUV2的RdRp區域構建系統進化樹。UvUV2與Purpureocilliumlilacinumnonsegmented virus 1(PINV-1)、Nigrosporaoryzaenonsegmented RNA virus 1( NoNRV-1)、Leshenaultpartiti-likevirus(LPLV)、Ustilaginoideavirensnonsegmented virus 1(UvNV-1)、 Bryopsis mitochondria-associated dsRNA(BDRM)形成了一個獨立的分支，與已分類的氨基酸序列不在一個分支，說明UvUV2與已分類病毒的同源關系較遠。UvUV2在基因組組織和序列上與PINV-1、NoNRV-1、LPLV、UvNV-1和BDRM高度相似，和相似性高的5株病毒在一個分類群。推斷，UvUV2與5株病毒一樣屬于未分類病毒，是一種新型真菌病毒，與Partitiviridae家族成員的RdRp有較遠的親緣關系，但與Amalgaviridae科和Totiviridae科的病毒不同。

3 結論與討論

通過對稻曲病菌菌株GZ-2中攜帶的真菌病毒 UvUV2的研究，獲取了該病毒的全基因組信息，從該病毒的基因組結構分析得知，UvUV2全長2 887個堿基，含有2個開放閱讀框(ORF1和ORF2)，ORF1長 561個堿基，BlastP比對結果表明編碼未知蛋白，ORF2長2 394個堿基，BlastP比對結果表明編碼依賴RNA的 RNA聚合酶(RdRp)。在UvUV2基因組序列(CCC_UUU_UAG563-571)中發現1個類似于甲型流感病毒基因組中的滑動序列(UCC_UUU_CGU)的基因序列，通過+1移碼促進Gag-Pol融合蛋白基因的表達。另外，BlastP的同源性搜索表明，UvUV2的ORF1和ORF2與PINV-1、NoNRV-1和UvNV-1共3種未分類病毒編碼的蛋白高度相似。綜上所述，表明UvUV2屬于新型未分類的病毒科。

在很多病毒的基因表達過程中存在一種叫程序性核糖體移碼(Programmed Ribosomal Frameshifting；PRF)的蛋白質翻譯調節機制，常見的類型包括，+1程序性核糖體移碼機制(+1PRF)和-1程序性核糖體移碼機制(-1PRF)。目前研究表明，+1PRF機制的產生只需要1個六聚體核糖體移碼序列元件(UUU_CGN， N=A，U，G，C)[23]。

在UvUV2基因組序列(CCC_UUU_UAG563-571)中發現了1個類似于甲型流感病毒基因組中的滑動序列(UCC_UUU_CGU)的基因序列，通過+1移碼[24]促進PA基因的表達。此外，在預測的滑動序列中，ORF1中存在1個終止密碼子(帶下劃線的CCC_UUU_UAG569-571)，表明其與Closteroviridae[25]家族成員和Euplotes屬纖毛原生動物[26]相似，在這些原生動物中，移碼發生在“移位停止”移碼位點[27]。這些位點由終止密碼子組成，前面緊跟著1個光滑的序列，可以允許+1移碼(纖毛蟲中的AAA和Closteroviridae科某些成員中的UUU)[25-26]。

利用ORF1推導的氨基酸序列進行的BlastP搜索顯示，序列與3種未分類病毒編碼的蛋白高度相似，即Purpureocilliumlilacinumnonsegmented virus 1(PINV-1)同源性為78%[4]、Nigrosporaoryzaenonsegmented RNA virus 1(NoNRV-1)同源性為53%[28]和Nigrosporaoryzaenonsegmented RNA virus 1(UvNV-1)同源性為40%[5]。根據BlastP分析，ORF2編碼的依賴于RNA的RNA聚合酶(RdRp)與Purpureocilliumlilacinumnonsegmented virus 1(PINV-1)同源性為78%與Nigrosporaoryzaenonsegmented RNA virus 1(NoNRV-1)同源性為45%和Nigrosporaoryzaenonsegmented RNA virus 1(UvNV-1)同源性為40%。這些數據表明，UvUV2很可能代表了一種感染稻曲病菌的新型dsRNA病毒。雖然UvUV2和UvNV1具有不分段的相似之處，并且具有類似于Totivirus的基因組結構，但其在基因組結構和長度上表現出不同。UvUV2的全序列(2 887 bp)比UvNV1的全序列(3 768 bp)短得多。此外，UvUV2的5′和3′非編碼區較短，分別為10 bp和62 bp，而UvNV-1的5′和3′非編碼區分別為741 bp和296 bp。因此，可以推測UvUV2是一種新型的、未分類的真菌病毒。