GFAP聯合cfDNA測定在復雜性熱性驚厥腦損傷中的臨床研究

凌寅杰朱焰 施明杰 路攀 袁琛

[摘要] 目的 研究復雜性熱性驚厥患兒靜脈血GFAP濃度、靜脈血和腦脊液的cfDNA含量，并評價兩者的相關性。方法 選擇2019年1～12月在湖州市第一人民醫院住院治療的78例CFS患兒作為研究組，選擇同期因發熱疑似伴顱內感染，最終經腦脊液檢查、腦電圖、頭顱MRI和病情觀察排除顱內感染的住院患兒27例為對照組。分別測定兩組患兒入院第1天和第5天的靜脈血GFAP濃度，測定兩組患兒入院當天的靜脈血和腦脊液cfDNA含量。結果 研究組患兒靜脈血GFAP水平（第1天和第5天）均較對照組水平升高，差異有統計學意義（P<0.05）。研究組患兒與對照組患兒之間的腦脊液cfDNA完整度具有顯著性差異，且研究組患兒的腦脊液cfDNA含量較對照組顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）。患兒靜脈血GFAP水平與腦脊液cfDNA水平呈正相關關系。 結論 通過GFAP聯合cfDNA含量測定，證實CFS患兒在分子和細胞層面存在驚厥后腦損傷。驚厥導致腦損傷的持續性，而非短暫消失，并可導致神經細胞死亡，引起腦脊液cfDNA濃度明顯增加。

[關鍵詞] GFAP;cfDNA;復雜性熱性驚厥;腦脊液;相關關系

[中圖分類號] R720.597? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）17-0029-04

Clinical study of GFAP combined with cfDNA determination in brain damage caused by complex febrile seizures

LING Yinjie? ?ZHU Yan? ?SHI Mingjie? ?LU Pan? ?YUAN Chen

Department of Pediatrics， Huzhou First Peoples Hospital in Zhejiang Province， Huzhou? ?313000， China

[Abstract] Objective To study the GFAP concentration of venous blood， cfDNA content in venous blood and cerebrospinal fluid in children patients with complex febrile seizures， and to evaluate the correlation between the two. Methods From January 2019 to December 2019， 78 children patients with CFS who were hospitalized for treatment in Huzhou First People's Hospital were selected as the study group. 27 hospitalized children patients suspected to be complicated with intracranial infection due to fever during the same period， who were excluded from intracranial infection through cerebrospinal fluid examination， electroencephalogram， skull MRI， and disease observation， were selected as the control group. The venous blood GFAP concentration in the two groups of children patients was determined on Day 1 and Day 5 of admission. The venous blood and cerebrospinal fluid（cfDNA） contents of the two groups of children patients were determined on the day of admission. Results The venous blood GFAP levels in the study group（Day 1 and Day 5） were higher than those in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There were significant differences in cerebrospinal fluid cfDNA integrity in children patients between the study group and the control group. The content of cfDNA in cerebrospinal fluid in the study group was increased significantly compared with that in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There was a positive correlation between venous blood GFAP levels and cerebrospinal fluid cfDNA levels in children patients. Conclusion GFAP combined with cfDNA determination confirms that children patients with CFS have brain damage after seizures at the molecular and cellular levels. Seizures cause persistent， not temporary disappearance of brain damage， and can lead to the death of nerve cells， causing a significant increase in cerebrospinal fluid cfDNA concentration.

[Key words] GFAP; cfDNA; Complex febrile seizures; Cerebrospinal fluid; Correlation

復雜性熱性驚厥（complex febrile seizures，CFS），是兒童期常見的神經系統疾病。目前CFS的具體發病機制不清，如離子通道機制、腦脊液的酸堿平衡異常、神經遞質失調等[1]。單純性熱性驚厥的患兒演變為癲癇的概率約2%～5%，而CFS則是其3.6倍[2]。除了增加罹患癲癇的風險外，CFS還可以造成不同程度的腦損傷。神經膠質纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidicprotein，GFAP）可作為驚厥后腦損傷的標志物[3]，但不能評價是否存在神經細胞壞死。循環游離DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）是存在于人體中，在細胞外處于游離狀態的DNA分子，其在人體血液和組織液等中均可檢出。cfDNA的相關檢測在產前診斷中已經取得了很多研究進展，另外通過對外傷、中風、顱內腫瘤和自身免疫性疾病患者的研究發現，其體內的cfDNA水平大大高于健康人[4-6]。而對于cfDNA在CFS患者中的研究報道較少。

本研究通過對78例CFS患兒和27例疑似顱內感染患兒的靜脈血和腦脊液cfDNA含量，以及不同時期靜脈血GFAP濃度進行測定，首次探討cfDNA含量與CFS腦損傷的關系，同時對于兩組患兒靜脈血及腦脊液cfDNA含量與靜脈GFAP濃度的相關性進行統計分析，為臨床上的診斷及預后提供參考。

1資料與方法

1.1臨床資料

選擇2019年1～12月在湖州市第一人民醫院住院診斷為復雜性熱性驚厥的患兒共78例設為研究組，同期因發熱疑似伴顱內感染，最終經腦脊液檢查、腦電圖、頭顱MRI和病情觀察排除顱內感染的住院患兒27例為對照組。研究組男48例，女30例，平均年齡（17.2±1.5）個月，平均發熱時間（4.2±0.4）d;對照組男16例，女11例，平均年齡（18.1±1.5）個月，平均發熱時間（3.9±0.5）d，兩組患兒的性別、年齡、平均發熱時間無顯著性差異（P>0.05），可進行統計學分析。所有參與本研究的患兒家屬均簽署知情同意書，本研究經湖州市第一人民醫院倫理委員會批準。

1.2納入標準

根據國內《熱性驚厥診斷治療與管理專家共識》（2016）[7]，CFS無嚴格限定年齡，在驚厥發作時，發熱超過38℃或者至少在發作后出現發熱，同時符合以下四項的一項及以上：①一次驚厥持續時間大于>15 min。②24 h內反復發作2次及以上。③局灶性發作。④發作后可有異常的神經系統表現或既往有神經系統缺陷。

1.3排除標準

①中樞神經系統急性或慢性疾病，如感染、外傷、出血、占位等。②患有嚴重的其他系統基礎疾病（如紫紺性心臟病、肝腎功能不全等）。③嚴重的遺傳代謝性疾病[8]。

1.4 方法

1.4.1 靜脈血GFAP濃度測定? 所有研究組、對照組患兒于入院第1天和第5天，分別采集靜脈血2 mL。待血液靜置后，在離心機中以4000 r/min 的速度離心5 min，留取血清后用-20℃冰箱中冷凍、保存、待測。采用ELISA法進行血清GFAP檢測，操作步驟嚴格按照試劑盒說明，檢測試劑盒購于上海瑤韻生物科技公司。

1.4.2靜脈血和腦脊液cfDNA濃度及完整性測定? ? 兩組患兒于入院當天抽取靜脈血3 mL，通過腰椎穿刺術留取腦脊液3 mL，將所采標本置于EDTA管中，離心（2500 rpm，5 min）后取上清液，利用FirePureTM Circulating Free DNA Mini Kit試劑盒（蘇州）提取cfDNA，每個標本最終洗脫體積為50 μL。提取的DNA經NanoDrop ND-1000核酸定量儀測定吸光度（A260/A280），取比值為1.6～1.8的樣本并對各樣本濃度進行測定。cfDNA完整性檢測采用定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術測定血漿ALU115基因（115bp）和ALU247基因（247bp）濃度，以ALU115/ALU247表示cfDNA的完整性。RT-PCR方法見參考文獻[9]。RT-PCR檢測ALU長短片段含量：根據TaKaRa公司SYBR Green Real-time PCR試劑盒的流程進行操作。引物序列：ALU-115bp上游5-CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG-3，下游5-CCCGAGTAGCTGGGATTACA-3;ALU247 bp上游5-GTGGCTCACGCCTGTAATC-3，下游5-CAGGCTGGAGTGCAGTGG-3，以上2對PCR引物均由上海生工生物工程公司合成。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火31 s，72℃延伸 32 s，40個循環，反應液配制在冰上進行，每個樣品重復3次。

1.5統計學處理

所有數據均采用SPSS19.0統計軟件進行統計分析，計數資料用百分率表示，采用χ2檢驗，計量資料用均數±標準差表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異有高度統計學意義。數據組間相關系數利用Correl方程[10]計算。

2 結果

2.1 兩組患兒靜脈血GFAP水平

研究組患兒靜脈血GFAP水平（第1天和第5天）均較對照組水平升高，差異有統計學意義（P<0.05）。其中研究組患兒隨著病程推移，靜脈血GFAP水平逐漸升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 兩組患兒cfDNA完整度比較

兩組cfDNA完整度檢測發現，研究組患兒與對照組患兒之間的靜脈血cfDNA完整度無顯著性差異（P>0.05）;研究組患兒與對照組患兒之間的腦脊液cfDNA完整度具有顯著性差異（P<0.05）。見表2。

2.3 兩組患兒cfDNA含量比較

通過熒光定量分析方法發現，相對于對照組，研究組患兒的腦脊液cfDNA含量顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05），而兩組的靜脈血cfDNA含量無顯著性差異（P>0.05）。見表3。

注：組間顯著性差異，a表示P<0.05，b為P>0.05

2.4 研究組患兒靜脈血GFAP濃度與其靜脈血和腦脊液的cfDNA水平相關關系

利用Correl方程對研究組患兒靜脈血GFAP濃度與其靜脈血和腦脊液的cfDNA水平進行相關性分析，結果顯示患兒靜脈血GFAP水平與靜脈血cfDNA水平的Correl系數為0.1805，無相關關系（P>0.05）。而患兒靜脈血GFAP水平與腦脊液cfDNA水平的Correl系數為0.9716，呈現正相關關系，差異有統計學意義（P<0.01）。

3討論

單純性熱性驚厥（Simple febrile seizures，SFS）指小兒伴有發熱的驚厥發作，并排除顱內感染和癲癇等疾病，預后良好。但復雜性熱性驚厥的特點為反復發作、長時間發作等，可對患兒產生驚厥后腦損傷，導致認知功能下降，甚至繼發癲癇[11]。

CFS的急性期治療，主要為控制驚厥和感染。現在有多種血清標志物提示驚厥后腦損傷，如神經元特異性烯醇化酶、腦源性神經營養因子、熱休克蛋白70、GFAP等[12-13]。本研究發現研究組患兒靜脈血GFAP水平（第1天和第5天）均較對照組水平升高，差異有統計學意義（P<0.05），再次證明GFAP是驚厥后腦損傷的可靠標志物。但研究組患兒靜脈血GFAP水平在第5天高于第1天，說明了驚厥腦損傷的持續性，而非短暫消失。目前的血清標志物只能在實驗室層面提示腦損傷存在，但缺乏立體的判斷。有研究表明，在部分CFS患兒早期進行頭顱MR檢測，發現海馬腫脹，而后逐漸演變為海馬硬化和萎縮[14-16]。但該檢查對影像診斷技術要求高，且缺乏統一的標準，容易造成誤診、漏診。這就需要從其他方向探索CFS腦損傷的相關研究。

cfDNA是一種細胞外游離狀態的DNA，可在人體血液和組織液中檢測到。其優點在于：大部分游離DNA多長度小于200 bp，易于檢測;可重復性好;不可透過血腦屏障[17]。對cfDNA的檢測在疾病的監控、胎兒的產前診斷及腫瘤的研究中已經有了很多應用[18-19]，但是其含量測定與CFS腦損傷關系研究甚少。通過熒光定量法，研究組患兒的腦脊液cfDNA含量較對照組顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05），而兩組靜脈血cfDNA含量無顯著性差異（P>0.05），提示驚厥可明顯增加腦脊液cfDNA濃度，而對靜脈血的cfDNA含量無明顯改變。由于細胞凋亡產生的ALU片段長度明顯短于非細胞凋亡產生的[20]，所以通過兩組cfDNA完整度檢測，我們發現研究組患兒與對照組患兒之間的靜脈血cfDNA完整度無顯著性差異;研究組患兒與對照組患兒之間的腦脊液cfDNA完整度具有顯著性差異。同時由于血腦屏障的作用，腦脊液中的cfDNA進入外周血，而外周血的cfDNA難以進入腦脊液。故可以推斷CFS患兒腦脊液增加的cfDNA是通過細胞死亡產生的。由于無法對人類大腦進行病理學的檢測，我們通過Correl方程分析，發現靜脈血GFAP水平與腦脊液cfDNA水平的Correl系數為0.9716呈正相關，意味著從分子和細胞的水平證實了CFS產生腦細胞損傷的部分機制。

綜上所述，對腦脊液cfDNA的測定，是明確CFS患兒存在腦損傷的依據。由于神經細胞的不可再生，故對CFS在臨床治療中需要強調預防和控制驚厥的發生和發展，同時對未來治療CFS腦損傷提供作用靶點。由于本研究納入的研究對象有限，需進一步增加樣本量，同時擬進一步對SFS患兒的腦脊液cfDNA的測定，以期獲得更加精準的研究數據。

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（收稿日期：2020-01-20）