腦脊液環介導等溫擴增和GeneXpert MTB/RIF在結核性腦膜炎早期診斷中的效能分析

樊麗超 陳宇 朱雅娟 曹宏麗

[摘要] 目的 分析和比較腦脊液環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和GeneXpert MTB/RIF（簡稱GeneXpert）在結核性腦膜炎早期診斷中的效能。 方法 選取沈陽市胸科醫院2018年6月～2019年6月疑診結核性腦膜炎的患者189例，采集患者抗結核治療前的腦脊液標本分別進行液體培養（MGIT）、LAMP和GeneXpert檢測。以液體培養法（MGIT）為標準，計算2種檢測技術在結核性腦膜炎診斷中的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、一致率、Kappa值。 結果 LAMP的敏感度為79.6%，特異度為94.3%，陽性預測值為83.0%，陰性預測值93.0%，一致率90.5%，Kappa值=0.749。GeneXpert的敏感度為98.0%，特異度為88.6%，陽性預測值為75.0%，陰性預測值為99.2%，一致率為91.0%，Kappa值=0.787。 結論 LAMP和GeneXpert對結核性腦膜炎檢測的靈敏度較液體培養（MGIT）明顯提高，可以在一定程度上提高臨床醫生對疑似結核性腦膜炎患者的診治能力，值得在基層結核病院實驗室廣泛推廣。

[關鍵詞] 結核性腦膜炎;腦脊液;環介導等溫擴增

[中圖分類號] R529.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）17-0128-04

Effectiveness analysis of CSF loop-mediated isothermal amplification and GeneXpert MTB/RIF in the early diagnosis of tuberculous meningitis

FAN Lichao? ?CHEN Yu? ?ZHU Yajuan? ?CAO Hongli

Department of Tuberculosis， the Tenth People's Hospital of Shenyang（Shenyang Chest Hospital）， Shenyang? ?110044， China

[Abstract] Objective To analyze and compare the efficacy of cerebrospinal fluid loop-mediated isothermal amplification（LAMP） and GeneXpert MTB/RIF（GeneXpert） in the early diagnosis of tuberculous meningitis. Methods A total of 189 patients with suspected tuberculous meningitis from Shenyang Chest Hospital from June 2018 to June 2019 were selected. Cerebrospinal fluid samples from patients before antituberculosis treatment were collected for mycobacterium growth indicator tube（MGIT）， LAMP， and GeneXpert tests. Using the mycobacterium growth indicator tube（MGIT） as the standard， the sensitivity， specificity， positive predictive value， negative predictive value， agreement rate， and Kappa value of the two detection techniques in the diagnosis of tuberculous meningitis were calculated. Results The sensitivity of LAMP was 79.6%， the specificity was 94.3%， the positive predictive value was 83.0%， the negative predictive value was 93.0%， the agreement rate was 90.5%， and the Kappa value was 0.749. The sensitivity of GeneXpert was 98.0%， the specificity was 88.6%， the positive predictive value was 75.0%， the negative predictive value was 99.2%， the agreement rate was 91.0%， and the Kappa value of 0.787. Conclusion The LAMP and GeneXpert in the detection of tuberculous meningitis have significantly higher sensitivity than that of mycobacterium growth indicator tube（MGIT）， which can improve the diagnosis and treatment ability of clinicians to patients with suspected tuberculous meningitis. It is worthy of widespread promotion in the laboratory of primary tuberculosis hospital.

[Key words] Tuberculous meningitis; Cerebrospinal fluid; Loop-mediated isothermal amplification

結核性腦膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是腦膜非化膿性炎癥，多數由結核分枝桿菌經血液循環或直接途徑侵入蛛網膜下間隙而引起，是結核病中最嚴重的類型之一，該病發病急緩不定，但病程都較長，致殘率和死亡率高，故早期診斷和盡早合理規范的治療，對改善患者的預后，降低后遺癥的發病率至關重要[1]。

傳統的TBM診斷金標準為腦脊液抗酸染色陽性或腦脊液結核菌培養陽性，但抗酸染色陽性率極低，結核菌培養耗時長，對TBM的早期診斷價值有限。環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術是可以檢測結核分枝桿菌的一種新型的恒溫核酸擴增技術，該方法操作簡單，報告快速，不需要昂貴的儀器設備，比較適合在基層實驗室推廣應用[2]。而GeneXpert MTB/RIF（簡稱GeneXpert）是一種新的利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術，目前在肺結核的檢測中敏感度和特異度較高，并且可用于腦脊液的檢測[3]，本文對沈陽市胸科醫院收治的189例疑診TBM的患者進行了腦脊液LAMP和腦脊液GeneXpert檢測，以腦脊液液體培養（MGIT）為金標準，評價兩種檢測手段檢測結核分枝桿菌的敏感度和特異度，探討其對結核性腦膜炎的診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年6月～2019年6月沈陽市胸科醫院結核七病區疑診TBM的患者189例，采集患者抗結核治療前的腦脊液標本分別進行液體培養（MGIT）、LAMP和GeneXpert檢測。

1.2 研究方法

1.2.1 腦脊液的采集和檢測? 所有患者均取入院后第一次腰穿腦脊液3 mL，標本采集前患者或家屬均簽署用于本次臨床試驗采取標本的知情同意書。所有實驗部分均由沈陽市胸科醫院結核病實驗室完成。

1.2.2 MGIT液體培養? 收集患者抗結核治療前的腦脊液，經4%NaOH溶液處理，取0.1 mL接種于酸性羅氏培養基，置于37℃恒溫培養箱培養，MGIT960液體培養系統由美國BD公司生產，將腦脊液標本按照BACTECTM MGIT生產規范（MGITTM Procedure Manual）要求進行培養[4]。

1.2.3 LAMP法? 收集患者抗結核治療前的腦脊液，采用熒光目測試劑盒[榮研生物科技（中國）有限公司]，腦脊液吸入吸附劑試管中混勻裂解（90℃，5 min）。將吸附管裝到樣本處理管上，搖晃5～10次后提取核酸，加上滴注蓋，輕壓樣本處理管將樣本滴入反應管中。充分混合后進行LAMP反應，于67℃反應40 min，然后放入恒溫熒光核酸擴增LF-160的熒光目視檢測單元，通過紫外線激發熒光觀察反應結果[5]。

1.2.4 GeneXpert? GeneXpert檢測儀及試劑盒由美國Cepheid公司生產，具體操作按照說明書進行。收集患者抗結核治療前的腦脊液，向1 mL腦脊液中加入1 mL樣本處理充分混勻，放置15 min并間斷搖晃，然后用無菌吸管將2 mL液體移入塑料試劑盒中，后者插入GeneXpert檢測平臺中，輸入樣品相關信息后運行儀器會自動進行樣品的過濾和洗滌，超聲溶菌釋放出DNA后與PCR反應試劑混合，半巢式實時擴增并檢測熒光信號，根據循環閾值的高（CT<16）、中（1628）的判定標準，2 h后儀器自動給出檢測結果[6]。

1.3 統計學分析

用SPSS20.0軟件進行統計分析，計算LAMP和GeneXpert的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、一致率和Kappa值。

2 結果

2.1 腦脊液LAMP檢測結果及腦脊液GeneXpert檢測結果

將189例患者的腦脊液標本進行液體培養（MGIT）、LAMP和GeneXpert檢測，液體培養陽性49例（25.93%），LAMP陽性47例（24.87%），GeneXpert陽性64例（33.86%）（表1、2）。

2.2 以液體培養檢測結果為標準判斷LAMP和GeneXpert檢測技術的診斷效能

以液體培養結果為標準，LAMP的敏感度為79.6%，特異度為94.3%，陽性預測值為83.0%，陰性預測值93.0%，一致率90.5%，Kappa值=0.749，說明兩者一致性較好。以液體培養結果為標準，GeneXpert的敏感度為98.0%，特異度為88.6%，陽性預測值為75.0%，陰性預測值為99.2%，一致率為91.0%，Kappa值=0.787，說明兩者一致性較好（表3）。

3討論

TBM是結核病最嚴重的類型之一，據統計，2017年全世界有1000萬人罹患結核，其中每年估計有10多萬例TBM新病例。面對如此嚴峻的疫情，TBM的診斷和治療情況卻不是很樂觀，因為TBM的臨床癥狀不典型，腦脊液載菌量低，導致病原學診斷率很低[7]。有文獻報道，早期確診的結核性腦膜炎病死率低于10%，而晚期確診的結核性腦膜炎病死率高達60%以上[8]。因此早期診斷對TBM患者至關重要，LAMP和GeneXpert等新的診斷技術的出現，有望提高結核性腦膜炎的早期診斷效率，以改善TBM患者的預后，提高治愈率，降低致殘率和死亡率。

本研究中腦脊液LAMP法檢測的敏感度為79.6%，特異度為94.3%，陽性預測值為83.0%，陰性預測值93.0%，一致率90.5%，Kappa值=0.749，說明兩者一致性較好。因此可認為LAMP的檢測結果接近液體培養（MGIT）結果，且比液體培養（MGIT）可檢測出更多的病原學陽性患者。劉洋等[9]采用LAMP檢測結核性胸膜炎患者的胸腔積液標本，靈敏度高達75.8%，顯著高于涂片法的39.6%，證明LAMP檢測可廣泛應用于肺外結核標本的檢測，且陽性率更高。

孫雯雯等[10]報道，在環介導等溫擴增技術早期診斷結核性腦膜炎的研究中，在LAMP法檢測陽性的病例中，有2例最后排除結核性腦膜炎診斷，提示本研究存在一定的假陽性率，主要原因可能是LAMP技術的高敏感性使樣品與反應體系污染，因此為了避免假陽性的出現，在操作工程中需實行分區操作，注意防止樣品間的交叉污染，嚴格控制可能導致污染的機會，避免假陽性的出現。

另外，本實驗也分析了LAMP檢測與液體培養不一致的18例結果，其中LAMP檢測陽性而液體培養檢測陰性為8例，LAMP檢測陰性同時液體培養陽性者10例。分析原因可能為：①液體培養陽性而LAMP陰性：標本性狀的影響，操作者采樣位置的影響，因LAMP只需要60 μL的標本，采樣時有可能會錯過陽性部位。②液體培養陰性而LAMP陽性：液體培養法檢出為活菌，而LAMP檢測的對象為結核分枝桿菌DNA，無論細菌是否存活皆能檢出[11]。

目前GeneXpert檢測痰標本用于肺結核的診斷已得到國際上的認可，文獻報道GeneXpert的靈敏度和特異度均很高，肺結核診斷總特異性為98.4%，總靈敏度為90.4%。但其對腦脊液、胸腹腔積液、關節液和心包積液等不同標本的敏感度有較高的異質性，需要更深的更大樣本量的研究[12]。在本研究中GeneXpert的敏感度為98.0%，特異度為88.6%，陽性預測值為75.0%，陰性預測值為99.2%，一致率為91.0%，Kappa值=0.787，說明兩者一致性較好。GeneXpert能夠快速檢測腦脊液中的結核分枝桿菌以及利福平耐藥，靈敏度較高，但陰性結果無法排除TBM的診斷[13]。目前國內外已經有多個研究，對超過1000份腦脊液進行GeneXpert檢測，評價GeneXpert診斷TBM的靈敏度約為80%，但是這些研究的腦脊液標本量較少，2009年英國感染學會《中樞神經系統結核病診斷和治療指南》建議，對于TBM患者，應該在抗結核藥物治療前留取不少于6 mL腦脊液進行病原學檢查，因此如果可能希望能夠每例獲得6 mL腦脊液通過離心富集結核菌進一步評價GeneXpert的檢測價值。

在本研究中，采用LAMP和GeneXpert檢測腦脊液敏感度和特異度較高，甚至高于國外的一些研究，考慮與納入的研究樣本有關，我科室收治的患者為遼寧省內疑難重癥病例，多為晚期TBM，患者病情重，腦脊液載菌量高有關，所以LAMP和GeneXpert檢測的陽性率較高。

綜上所述，LAMP作為一種新型的核酸擴增技術，所需的儀器設備簡單，價格低廉。可以針對靶基因設計引物，有較高特異性，且整個擴增過程較快，約60 min即可完成，操作步驟簡單，肉眼即可判斷結果，對檢驗人員要求較低[14]。與傳統的細菌學檢測手段相比，其操作更加容易、便捷、生物安全性更好。GeneXpert可檢測結核分枝桿菌感染和RIF耐藥基因，擴增的靶基因為利福平耐藥基因相關基因的81個堿基對的高突變熱點區域，整個過程用時短，約2 h可完成，操作簡單，幾乎為全自動化檢測，全天可完成超過1000個樣本[15]。且GeneXpert陽性率明顯高于液體培養，在有條件的醫療機構，有較廣泛的應用前景。LAMP和GeneXpert對TBM檢測的靈敏度較液體培養（MGIT）明顯提高，并且與液體培養結果一致性較好，GeneXpert同時可提供利福平耐藥情況，LAMP操作簡單、價格低廉，可以在一定程度上提高臨床醫生對疑似TBM患者的診治能力，值得在基層結核病院實驗室廣泛推廣。

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（收稿日期：2020-02-05）