綠茶多酚對急性腦出血大鼠抗氧化能力及神經細胞凋亡的影響

王紅磊 韋紅巧 李祝森 秦英 馮勛偉 陳栩栩 陳攀紅 周靜

廣西醫科大學1基礎醫學院生理學教研室，2臨床醫學專業（南寧530007）

急性腦出血（acute cerebral hemorrhage，ACH）是指非外傷性腦實質內出血，為當今臨床上常見的腦血管疾病之一［1］。研究［2］顯示，ACH 發病1 個月內的病死率在我國高達40%，而且多伴隨有嚴重的神經功能缺損癥狀，預后效果較差，目前對其尚缺乏有效的預防治療手段［3］。綠茶多酚（green tea polyphenol，GTP）因具有良好的抗氧化、抗凋亡、減輕機體自由基損傷、神經細胞保護、預防心血管疾病等多種功能，在阿爾茲海默病、癡呆等神經系統疾病中都顯示出保護作用［4-6］。但關于綠茶多酚應用于急性腦出血方面的相關研究相對較少，本實驗通過建立急性腦出血大鼠模型，并給予綠茶多酚進行干預，觀察其對大鼠神經功能缺失、腦組織抗氧化能力及神經元損傷的影響，旨在為急性腦出血性疾病的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器清潔級成年SD雄性大鼠40 只，體質量為240～270 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供［動物合格證號：SCXK（桂）2003-0003］。經過適應性喂養，飲食、飲水正常、無不良反應者，納入實驗；Ⅳ型膠原酶（購自美國Sigma 公司）；綠茶多酚（購自安徽蕪湖天遠生物科技有限公司，純度≥98%）；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）；TUNEL試劑盒（購自上海碧云天公司）；大鼠腦立體定位儀（購自瑞沃德公司）。

1.2 動物分組及急性腦出血模型制備取適應性喂養后的SD 雄性大鼠40 只，隨機分為：假手術組、模型對照組和綠茶多酚組，每組又分為3 d和7 d 兩個時間點組，假手術組12 只，其他各組14 只。采用膠原酶加肝素腦內定點注射建立大鼠急性腦出血模型：大鼠稱重后，10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）腹腔注射麻醉，固定于鼠腦立體定位儀上，常規備皮消毒，沿顱頂正中線切開皮膚，暴露顱骨標志，參照《大鼠腦立體定位圖譜》［7］進行左側內囊定位：前囟后1.8 mm，中線左旁開3.2 mm，深5.4 mm。用牙科鉆鉆開顱骨，微量進樣器抽取含肝素的膠原酶溶液（Ⅳ型膠原酶0.25 U/μL，肝素2.5 U/μL）0.65 μL 校準上述進針點后垂直進針5.4 mm，緩慢注入，1 min 內注完，留針5 min，緩慢退針，縫合頭皮。假手術組不注射藥物，其余手術過程相同。術后死亡的大鼠被剔除，并補足相應的大鼠數目。

1.3 藥物治療急性腦出血模型制備成功后，綠茶多酚組以60 mg/（kg·d）腹腔注射綠茶多酚，模型對照組和假手術組腹腔注射等量生理鹽水，1 次/d，連續給藥3 d 或7 d，于末次給藥2 h 后進行神經功能和行為學評分，并斷頭取腦組織進行相關指標檢測。

1.4 神經功能行為學評分采用改良Garcia 法［8］進行神經功能行為學評分，測試指標包括：（1）自發性活動（0 分：大鼠完全不動；1 分：大鼠幾乎不動；2 分：大鼠刺激后活動；3 分：大鼠活動頻繁，至少接觸籠子三面）；（2）四肢運動對稱性試驗（0 分：大鼠右前肢完全癱瘓；1 分：大鼠右前肢輕微移動；2 分：大鼠右前肢小幅度運動；3 分：大鼠四肢對稱性伸展）；（3）前爪伸展試驗（0 分：大鼠右前肢無移動；1 分：大鼠右前肢輕微移動；2 分：大鼠右側肢體伸展度小于左側；3 分：大鼠雙前肢伸展）；（4）攀爬試驗（1 分：大鼠無法攀爬；2 分：大鼠右側肢體受損；3 分：大鼠攀爬輕松、抓壁用力）；（5）本體感覺試驗（1 分：大鼠右側肢體無反應；2 分：大鼠右側肢體反應緩慢；3 分：大鼠兩側肢體反應對稱）；（6）對觸摸觸須的反應（1 分：大鼠右側肢體無反應；2 分：大鼠右側肢體反應緩慢；3 分：大鼠兩側肢體反應對稱）。神經功能行為學的得分為6 項指標分數的總和，分數越低，表示神經功能障礙越重。

1.5 腦組織MDA 的含量及SOD、GSH-Px 酶活性測定于神經功能行為學評分后，麻醉大鼠，快速斷頭取全腦，冰生理鹽水漂洗干凈，分離左腦皮層，濾紙吸干后準確稱重，按重量體積比加入9 倍的冰生理鹽水制成10 %的勻漿，4 000 r/ min 離心10 min，取上清液保存于-20℃冰箱待測。硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA 含量；黃嘌呤氧化酶法測定SOD 活力；5′，5-雙硫代對硝基苯甲酸（DTNB）直接法測定GSH-Px 活力，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 HE 染色處死各組大鼠，留取皮質、海馬，置于4%多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋、切為4 μm厚切片，經二甲苯脫蠟及不同濃度乙醇水化后，行HE染色，40倍光鏡下觀察皮質、海馬部位病理學改變。

1.7 TUNEL 法檢測細胞凋亡處死各組大鼠，留取皮質、海馬，置于4%多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋、切為4 μm 厚切片，經二甲苯脫蠟及不同濃度乙醇水化后，用蛋白酶K 于20～37 ℃處理10～30 min。PBS 漂洗3 次后用3%的H2O2于室溫處理20 min，隨后PBS 清洗3 次。然后按TUNEL 檢測試劑盒說明書進行生物素標記，經DAB 顯色、蘇木素復染、返藍、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下每張切片隨機選取5 個高倍鏡視野（×400）觀察計數，以細胞出現棕色染色為TUNEL陽性細胞，取陽性細胞比率進行統計學分析。

1.8 統計學方法實驗數據應用SPSS 20.0 軟件進行統計分析，作圖采用GraphPad Prism8 軟件。計量資料采用均數±標準差表示，組間差異性分析采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能行為學評分與假手術組比較，模型對照組、綠茶多酚組大鼠的神經功能行為學評分均降低（P＜0.001）；給藥7 d 后，綠茶多酚組大鼠的神經功能學評分較模型對照組提高（P＜0.05），見表1。

2.2 綠茶多酚對大鼠急性腦出血后腦組織MDA含量和SOD、GSH-Px 活性變化的影響與假手術組比較，模型對照組、綠茶多酚組的大鼠腦組織中MDA 含量均上升（P＜0.05），而SOD、GSH-Px 活性則下降（P＜0.05）；給藥7 d 后，與模型對照組比較，綠茶多酚組大鼠腦組織中MDA 的含量下降（P＜0.05）、SOD 和GSH-Px 的活性上升（P＜0.05），見表2、圖1。

表1 綠茶多酚對大鼠急性腦出血后神經功能行為學評分的影響Tab.1 Effects of green tea polyphenols on neurobehavioral scores after acute intracerebral hemorrhage in rats ±s，分

表1 綠茶多酚對大鼠急性腦出血后神經功能行為學評分的影響Tab.1 Effects of green tea polyphenols on neurobehavioral scores after acute intracerebral hemorrhage in rats ±s，分

注：與假手術組比較，★P ＜0.001；與模型對照組比較，△P ＜0.05

組別假手術組模型對照組綠茶多酚組動物數12 14 14 3 d 17.67±0.52 11.29±2.43★13.43±1.81★7 d 17.83±0.41 14.43±0.79★15.57±0.98★△

表2 綠茶多酚對大鼠急性腦出血后腦組織MDA 含量和SOD、GSH-Px 酶活性變化的影響Tab.2 Effects of Green Tea polyphenols on MDA content，SOD and GSH-Px enzyme activity in brain tissue of Rats with Acute intracerebral Hemorrhage ±s

表2 綠茶多酚對大鼠急性腦出血后腦組織MDA 含量和SOD、GSH-Px 酶活性變化的影響Tab.2 Effects of Green Tea polyphenols on MDA content，SOD and GSH-Px enzyme activity in brain tissue of Rats with Acute intracerebral Hemorrhage ±s

注：與假手術組比較，★P ＜0.01；與假手術組比較，△P ＜0.05；與模型對照組比較，※P ＜0.05

組別假手術組模型對照組綠茶多酚組MDA 含量（nmol/mgprot）3 d 0.66±0.13 1.03±0.19★0.91±0.21△7 d 0.62±0.19 1.24±0.30★0.89±0.21△※SOD 酶活性（U/mgprot）3 d 1.45±0.19 0.94±0.22★1.10±0.27△7 d 1.46±0.14 1.07±0.14★1.26±0.17△※GSH-Px 酶活性（U/mgprot）3 d 35.34±2.34 30.49±4.55△31.01±3.76△7 d 37.22±2.88 30.82±2.93★33.94±1.53△※

圖1 綠茶多酚對大鼠急性腦出血后腦組織MDA 含量和SOD、GSH-Px 酶活性變化的影響Fig.1 Effects of Green Tea polyphenols on MDA content，SOD and GSH-Px enzyme activity in brain tissue of Rats with Acute intracerebral Hemorrhage

2.3 綠茶多酚對大鼠急性腦出血后腦組織病變的影響假手術組大鼠皮質、海馬組織形態正常，細胞周圍間隙正常，細胞核圓潤，核染色質均勻清楚；與假手術組比較，模型對照組大鼠皮質、海馬組織形態明顯異常，組織間隙腫脹，細胞核固縮、濃染甚至破裂，部分細胞出現壞死、消失；給藥7 d后，與模型對照組比較，綠茶多酚組大鼠皮質、海馬組織形態改善，細胞周圍間隙、細胞核固縮程度均減小，神經細胞皺縮程度改善，壞死細胞減少，見圖2。

2.4 綠茶多酚對大鼠急性腦出血后腦組織細胞凋亡的影響光鏡下可見凋亡（陽性）細胞為棕色，陰性細胞為藍紫色。與假手術組比較，模型對照組大鼠皮質、海馬部位細胞排列松散，神經元凋亡均顯著增加（P＜0.001）；給藥7 d 后，與模型對照組比較，綠茶多酚組大鼠皮質、海馬部位細胞排列重歸緊密，且神經元凋亡均顯著下降（P＜0.001），見圖3。

圖2 大鼠皮質、海馬部位病理結果比較（HE 染色，×400，n=6）Fig.2 Comparison of pathological results of cortex and hippocampus in rats（HE staining，×400，n=6）

圖3 TUNEL 法檢測大鼠皮質、海馬部位神經細胞凋亡（TUNEL 染色，×400，n=6）Fig.3 Detection of neuronal apoptosis in cortex and hippocampus of rats by TUNEL method(TUNEL staining,× 400,n=6)

3 討論

急性腦出血是我國臨床上常見的一種疾病，具有較高的致殘率和病死率，同時也因其有發病急、病情復雜危險、患者預后效果不佳等特點，現已成為臨床上的一大難題［9］。氧化應激（oxidative stress）是指當生物體內氧化物與抗氧化物的動態平衡被打破時，所表現出的潛在損傷狀態，其參與急性腦出血后的腦組織損傷病理過程，并在神經元損傷過程中具有重要作用［10］。研究證實［11～13］，在急性腦出血后的氧化應激過程中，機體可生成大量的氧自由基和MDA，進而對腦組織產生毒性作用［14］。而過量氧自由基的釋放又可以誘導細胞中相關因子的活化，進而導致神經細胞凋亡的發生［15］，而MDA 可加快機體內胺類的氧化代謝，抑制單胺類物質的合成，嚴重損傷神經功能，亦可引發神經細胞凋亡，進而導致明顯的行為學障礙［16］。同時，機體中已存在的能清除或抑制氧自由基的抗氧化物質如SOD、GSH-Px 的含量也會在氧化應激過程中發生大量消耗，使得機體抗氧化能力減弱，利于合成MDA，加劇腦損傷程度［17-19］。本實驗中，通過建立急性腦出血大鼠模型，觀察到模型對照組大鼠腦組織中MDA 的含量上升，而SOD、GSH-Px活性下降，表明大鼠急性腦出血后腦組織中存在有氧化應激效應以及抗氧化能力的減弱，這與ZHANG 等［20］、ALADAG 等［21］研究結果一致，同時較之假手術組，模型對照組大鼠皮質、海馬部位病理損傷明顯，神經細胞凋亡增加，也提示腦組織中抗氧化能力的減弱，會導致神經元過度凋亡現象。

綠茶多酚是綠茶中兒茶素類、黃酮類、芬酸類等一系列化合物的總稱，其藥理活性多樣，因其化學結構中包含有多酚羥基，易被氧化而提供出H+質子，故而具有極強的抗氧化能力［22］。已有學者研究發現［23］，在肝、腎及腦損傷導致的氧化應激效應中，綠茶多酚均能夠有效增強機體的抗氧化能力，減輕氧化損傷程度，并可以阻斷細胞凋亡通路，抑制細胞凋亡過度，進而對受損部位起到一定的保護作用。本實驗表明，在給予綠茶多酚治療7 d 后，與模型對照組的大鼠比較，綠茶多酚組大鼠神經功能行為學評分的得分顯著升高，腦組織中SOD 和GSH-Px 活性增加、MDA 水平下降，提示綠茶多酚可以有效改善因急性腦出血導致的神經功能損傷，并可提高腦組織的抗氧化應激能力，同時HE與TUNEL 染色也顯示綠茶多酚可改善急性腦出血大鼠皮質、海馬部位病理損傷，顯著降低神經細胞凋亡，這與DING 等［24］研究結果相似。

綜上所述，筆者認為綠茶多酚對急性腦出血后腦損傷的保護作用與其能顯著改善急性腦出血后機體的抗氧化能力、減輕神經細胞凋亡有關，這可為綠茶多酚在急性腦出血治療中的應用提供實驗依據。此外，綠茶多酚對急性腦出血后腦損傷中的神經細胞的保護機制有待進一步探討，這也為急性腦出血性疾病的臨床防治提供新的方法和思路。