香菇多糖對膿毒癥大鼠模型肺水代謝的影響研究＊

巫莉萍，薛小燕，溫建東

（江西省贛州市人民醫(yī)院，贛州 341000）

膿毒癥是燒傷、創(chuàng)傷、外科術(shù)后等較常見嚴重并發(fā)癥， 是因細菌感染引起的全身性炎性反應綜合征， 是一種病死率較高的難治性并發(fā)癥， 據(jù)統(tǒng)計，膿毒癥病死率在30%-50%[1]。 膿毒癥易并發(fā)多臟器功能障礙綜合征（MODS），其中肺損傷是最先出現(xiàn)、發(fā)生率最高的一個癥狀，是導致死亡主要原因，病死率增高至70%，是迄今臨床迫切需要解決的棘手問題[2]。 臨床研究表明，肺水代謝障礙是肺損傷發(fā)生機制的一個中心環(huán)節(jié)， 在肺損傷發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要影響。 諸多研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖有著抗炎、抗腫瘤、改善機體免疫等作用。 但是關(guān)于香菇多糖抗炎機制尚不明確， 特別是在膿毒癥中對肺損傷的肺水代謝的影響研究不多。 本研究分析香菇多糖對膿毒癥大鼠模型肺水代謝的影響，以便進一步明確香菇多糖的抗炎作用機制， 現(xiàn)如下報告。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 將40 只健康雄性大鼠 （由贛南醫(yī)學院實驗動物中心提供）納入本課題研究中，體重170-230g，平均（200.5±10.2）g。 有關(guān)操作均嚴格按照“實驗動物保護原則”進行，由專人飼料喂養(yǎng)，自由飲食，飼料和用水無污染且新鮮，飼養(yǎng)場所室內(nèi)溫度（22.0±1.0）℃，濕度（55±5）%。 DMSO 均購自西格瑪公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 所有小鼠在分組前禁食過夜，但可自由飲水。 采用經(jīng)典CLP 術(shù)創(chuàng)建膿毒癥模型，所有操作均在SPF 手術(shù)間舉行，均在上午進行。 腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30-50 mg/kg）麻醉，腹部皮膚應用75%乙醇徹底消毒，腹部1/4 象限皮膚內(nèi)作一道3-4cm 的縱切口， 逐步打開并深入多， 暴露腹腔，找到盲腸取出外，于盲腸1/2 處應用3-0 絲線結(jié)扎盲腸（約結(jié)扎50%），于結(jié)扎盲腸中間用單針頭（18G）自系膜側(cè)指往系膜對側(cè)貫穿性穿孔，自穿孔內(nèi)輕輕擠出一小點糞便到盲腸外， 再納回盲腸，逐層縫合， 再在皮下注射0.9%生理鹽水 （37℃，5 ml/100 g 體重）行液體復蘇，最后放回。

1.2.2 香菇多糖制備 取干燥處理小冬菇250g，加水浸泡10min 后剪碎， 應用乙醇回流脫脂12h，然后行真空干燥。 再應用熱水提取3 次，殘渣用5%氫氧化鈉溶液持續(xù)浸泡24h，殘渣棄除，浸泡液通過36%醋酸中和，通過離心棄除沉淀，將上清液濃縮到1000ml 后加入等體95%乙醇，再靜置過夜就會對離心得到沉淀物作為香菇粗多糖。該多糖溶液應用1%的雙氧水脫色，脫色處理后的多糖溶液通過微濾處理后， 應用500kDa 超濾膜分級分離，超濾收集樣品經(jīng)凍干后得到精制香菇多糖。

1.2.3 分組及干預 將本研究選定的大鼠隨機隨機隨機分成正常對照組、膿毒癥模型組、香菇多糖預防組及香菇多糖治療組，每組10 只。正常對照組每日腹腔注射0.9%生理鹽水2.5ml/kg； 膿毒癥模型組則每日腹腔注射蒸餾水2.5ml/kg；香菇多糖預防組在建模前腹腔注射100mg/kg 香菇多糖; 香菇多糖治療組在建模后腹腔注射香菇多糖100mg/kg。每組均連續(xù)治療3d。

1.2.4 檢測 ⑴肺水代謝測定：在干預完成后第2d處死大鼠， 應用10%水合氯醛溶液腹腔注射，0.3ml/100g 麻醉，待麻醉后，沒有意識時，采用腹腔腹主動脈采血， 使大鼠失血死亡， 然后取出心臟和肺， 應用4-8℃的0.9%生理鹽水沖洗。 結(jié)扎左肺門，對右肺支氣管肺泡進行灌洗，收集肺泡灌洗液5ml，然后以 2000r/min，離心 10min，取上層清液置于-70℃凍存，采用Bradford 法測定BALF、血清蛋白濃度，計算兩者的比，即LPI。 ⑵病理學HE 染色及評分：取左肺放于4%的多聚甲醛中固定24h，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯浸透、石蠟包埋、5μm 厚切片、二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水、HE 常規(guī)染色、封片后光鏡下觀察肺組織病理變化。 每個標本由同一名病理醫(yī)生根據(jù)肺間質(zhì)水腫、肺泡水腫、炎細胞浸潤、肺泡出血、透明膜形成、肺不張改變，按程度無、輕、中、重，分別計 0，1，2，3 分。 另外，取部分左肺下部組織置于-70℃冰箱凍存， 以Western Blot法檢測肺組織內(nèi)的 AQP1、AQP5 的表達， 以 βactin 蛋白表達為參照， 采用Quantity One 圖像系統(tǒng)掃描、分析，以光密度比值表示。 應用濾紙吸干剩余左肺下葉組織的水分， 然后應用分析天平精確稱濕重(w)，再置入80℃烤箱內(nèi)連續(xù)烘烤48h 后，再稱干重(D)，計算肺 W/D[3]。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0 軟件包完成本課題研究的統(tǒng)計學處理，呈正態(tài)分別計量指標用（）表示，多組間以t 檢驗；計數(shù)指標則用例數(shù)（%）表示， 組間以 χ2檢驗，P＜0.05 表示存在統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四組肺組織病理變化 通過HE 染色顯示，正常對照組大鼠的肺泡、肺泡管、肺泡隔、支氣管上皮等形態(tài)均完整，肺泡壁厚度正常，管腔內(nèi)無炎性細胞和分泌物； 膿毒癥模型組大鼠肺泡壁彌漫性增厚，肺泡壁血管充血，部分肺泡實變，腔內(nèi)大量炎性滲出物，支氣管周圍組織彌漫性增生；香菇多糖預防組大鼠肺泡壁輕度增厚，少量肺泡隔斷裂，中度炎性細胞滲出； 香菇多糖治療組病變顯著減輕，肺組織形態(tài)相對完整，少量炎性細胞滲出，如圖1。從病理學看，膿毒癥模型評分最高，其次是香菇多糖預防組，均高于正常對照組、香菇多糖治療組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），如表 1。

圖1 大鼠肺組織病理變化

表1 不同組大鼠肺組織病理學評分對比（，分）

表1 不同組大鼠肺組織病理學評分對比（，分）

組別 數(shù)量 病理學評分正常對照組膿毒癥模型組香菇多糖預防組香菇多糖治療組10 10 10 10 0 F P 14.76±1.33 7.18±1.18 3.52±0.40 5.188 0.001

2.2 不同組肺水代謝指標水平對比 通過測定，香菇多糖高治療組、 香菇多糖干預組及膿毒癥模型組的 AQP1、AQP5 均低于對照組,而 LPI、W/D 均顯著高于對照組（P＜0.05），且香菇多糖高治療組各指標水平均優(yōu)于香菇多糖干預組（P＜0.05），如表2。

表2 不同組大鼠模型肺水代謝指標水平比較（）

表2 不同組大鼠模型肺水代謝指標水平比較（）

組別 數(shù)量 AQP1 AQP5正常對照組膿毒癥模型組香菇多糖預防組香菇多糖治療組10 10 10 10 t P 1.04±0.18 0.32±0.10 0.57±0.23 0.83±0.36 10.283 0.001 0.56±0.10 0.19±0.05 0.30±0.08 0.42±0.04 15.036 0.000 LPI 1.44±0.40 5.43±1.60 3.15±1.43 1.92±0.80 17.017 0.000 W/D 4.22±0.86 8.05±1.33 6.55±1.24 4.97±1.30 14.724 0.001

2.3 各組大鼠 AQP1、AQP5 表達 Western Blot 法檢測顯示，正常組AQP1、AQP5 表達最高，其次是香菇多糖治療組，再次是香菇多糖預防組，膿毒癥模型組最低（P＜0.05），如圖 2。

3 討論

圖2

膿毒癥發(fā)病早期表現(xiàn)為全身性能高炎性反應綜合征，機體產(chǎn)生過度氧化應激與大量炎性因子，并隨多臟器功能損傷，肺臟是最為直接、最容易受到損傷的臟器。 在大量炎性細胞浸潤到肺組織，促炎因子大量釋放，對內(nèi)皮細胞造成直接性損傷，使血管通透性增高，引起肺水腫和呼吸困難，嚴重威脅到患者生命安全。

水通道蛋白(AQPs)是一種能介導自由水跨膜轉(zhuǎn)運的同源蛋白家族總稱， 在人的呼吸系統(tǒng)中主要有 AQP1、AQP3、AQP4 及 AQP5 等四種表達。 其中，AQP1、AQP5 和肺損傷密切相關(guān)， 是反映肺水腫重要指標。 AQP1 分布在氣道周圍的毛細血管、淋巴管以及肺泡毛細血管的內(nèi)皮細胞中， 功能就是負責清除支氣管與脈管周圍組織中的水分；AQP5 存在于肺泡I 型上皮細胞和氣道分泌上皮細胞，功能就是清除肺泡腔內(nèi)水分。 臨床研究發(fā)現(xiàn)，和野生型比較，AQP1 基因敲除小鼠的肺泡毛細血管間水滲透性、 通透性降低10 多倍；AQP1、AQP5都敲除小鼠則降低25-30 倍，發(fā)生嚴重肺水腫。 可以看出，AQP1、AQP5 特異性轉(zhuǎn)運水分子， 能有效維持血管和間質(zhì)間的水平衡[4,5]。肺損傷的膿毒癥一個嚴重并發(fā)癥，其病理主要是肺泡-毛細血管急性損傷，引起通透性增高，肺間質(zhì)滲出、水腫，肺通氣和血流比失調(diào)，炎性細胞浸潤等，肺部影像學表現(xiàn)出非均一性滲出性病變。 臨床研究發(fā)現(xiàn)[6]，AQP1、AQP5 在肺損傷后肺內(nèi)液體平衡調(diào)控中發(fā)揮重要作用，直接參與到肺水腫發(fā)生。

香菇多糖是一種自食物香菇內(nèi)提取出的物質(zhì)，有著抗腫瘤、調(diào)節(jié)機體免疫、抗菌、抗氧化等多種生物學活性，其作為T 細胞免疫強化劑，可激活NK 細胞、 中性粒細胞以及巨噬細胞等免疫細胞[7,8]。 本研究結(jié)果顯示，香菇多糖高治療組、香菇多糖干預組及膿毒癥模型組的AQP1、AQP5 均顯著低于對照組， 而 LPI、W/D 均顯著高于對照組 （P＜0.05），且香菇多糖高治療組各指標水平均優(yōu)于香菇多糖干預組（P＜0.05）。 應用香菇多糖干預后，上述變化具顯著改善，LPI、W/D 降低，AQP1、AQP5 表達增高，與相關(guān)課題研究報道基本一致[9,10]。 由此提示香菇多糖可能通過上調(diào)AQP1、AQP5 表達，改善大鼠肺水代謝， 減輕肺水腫， 進而有效減小肺損傷，保護肺臟。

綜上而言， 香菇多糖能有效改善膿毒癥引起的肺水代謝，有助于預防肺損傷，促進病情轉(zhuǎn)歸，具有重要的臨床治療價值。