高危孕婦產前診斷胎兒性染色體異常的遺傳學分析

肖鈞方，劉艷秋，鄒永毅，馬鵬鵬，周吉會

(江西省婦幼保健院產前診斷中心，南昌 330006)

中國是出生缺陷高發的國家之一， 其中染色體病是導致胎兒嚴重智力低下及先天畸形的主要原因，且無有效的治療方法[1,2]。 性染色體異常臨床表型多樣，嚴重的會導致胎兒生殖器官發育不全，并可伴其他臟器結構功能異常、智力低下、精神及神經功能障礙，成年后可出現不孕不育，其對個人心理及生理的影響相較其他系統畸形可能更為嚴重[3,4]。 傳統的染色體G 顯帶核型分析技術是診斷胎兒染色體核型的金標準,但耗時長，分辨率有限。拷貝數異常（copy number variations，CNVs）是指基因組結構一般長度在1kb 以上重復、 缺失的亞顯微結構變異[5]。 CNVs 可以通過比較基因組雜交（a CGH）和單核苷酸多態性微陣列(SNP-array)芯片技術進行檢測,或者利用全基因組測序(CNV-seq)數據進行計算推斷[6]。 熒光原位雜交(FISH，fluorescence in situ hybridization）技術是利用堿基的互補配對將熒光標記的探針與目的DNA 進行雜交，通過熒光顯微鏡觀察并計數， 使用間期細胞時無需培養，診斷周期快速，成功率高，對染色體嵌合診斷價值較高。 無創產前DNA 篩查對胎兒染色體非整倍體疾病21 三體、18 三體及13 三體檢出率較高，對檢測胎兒性染色體也具有一定價值[7]。 本研究通過運用多種遺傳學方法對3591 例高危孕婦進行產前診斷， 總結其中性染色體異常與產前診斷指征之間的相關性， 并分析探討不同遺傳學技術的診斷價值，為產前診斷的臨床咨詢提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集 2018 年 1 月-2019 年 12 月在因不同產前診斷指征在江西省婦幼保健院產前診斷中心行絨毛、 羊水、 臍血穿刺檢查的孕婦3591例。 年齡 17-47 歲，孕周 11-32 周。 根據不同的產前診斷指征分組：高齡組為預產年齡≥35 歲，建議直接行介入性產前診斷； 唐篩異常組為血清篩查21 三體、18 三體高風險；超聲異常組為超聲提示胎兒軟指標異?；蚪Y構異常， 如頸部透明層增厚、腎盂增寬、側腦室增寬等；無創DNA 異常根據檢查結果分為無創DNA 高風險組和性染色體異常高風險組；不良孕產史組為死胎、畸胎引產史或生育過出生缺陷兒病史等； 其他原因組為孕早期服用藥物史、接觸放射線、不良工作環境、夫婦染色體異常或單基因病攜帶等情況。最后納入診斷結果為不合并常染色體異常的性染色體異常病例。上述各組之間無交叉情況。 所有孕婦無介入性產前診斷禁忌證，且均簽署產前診斷知情同意書。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2 方法 在超聲實時引導下，行絨毛穿刺活檢術（孕 11-14 周）、羊膜腔穿刺術（孕 18-24 周）、臍靜脈穿刺術（孕24 周后）。抽取絨毛、羊水或胎兒臍靜脈血標本進行染色體顯帶技術、FISH 原位雜交，征得孕婦同意后應用全基因組測序拷貝數變異分析（CNV-seq） 或染色體微陣列（CMA）CytoScan750k芯片進行染色體微缺失和微重復的檢測。用國際數據 庫 包 括 DECIPHER、Database of Genomic Variants (DGV)、Online Mendelian Inherit-ance in Man(OMIM)、UCSC Genome Browser、ENS EMBL 等進行致病性分析，依據 ACMG（American College of Medical Genetics and Genomics） 判 讀 指 南 進 行CNVs 致病性的判讀。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，計數資料用百分率表示，各組間率的比較用χ2檢驗。 P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同產前診斷穿刺指征下的性染色體異常胎兒檢出情況 3591 例不同產前診斷指征下的高危孕婦經染色體核型分析、FISH、CMA/CNV-seq 檢測共檢出性染色體異常胎兒137 例， 性染色體異常檢出率約為3.81%。不同產前診斷指征的性染色體異常檢出率不相同，無創DNA 組的性染色體異常組檢出率在所有組別中最高，為51.85%。詳細檢出情況見表1。各組間的異常率比較差異具有統計學意義（χ2=1071.319，P＜0.001）, 無創 DNA 性染色體異常組與其他各組比較均存在差異。

表1 不同產前診斷指征組構成比和性染色體異常檢出率[n(%)]

2.2 性染色體異常類型分布情況 137 例性染色體異常胎兒中染色體數目異常95 例， 包括45,X 12例，45,X 嵌合體 16 例，47,XXY 28 例，47,XXY 嵌合 2 例 ，47,XXX 12 例 ，47,XXX 嵌 合 1 例 ，48,XXXX 1 例，47,XYY 21 例，47, inv(Y)(p11q11) ,inv(Y)(p11q11) 2 例。 染色體結構異常42 例 包括46,X,psu dic(X)(p11.2) 1 例，46,X,psu idic(Y)(p11.3) 1例，46,X,inv(Y)(p11q11) 12 例，46,X,Yqh- 4 例，46,X,Yqh+ 1 例，46,X,Yqs 1 例，X 染色體片段缺失 6例，X 染色體片段重復 16 例。

2.2.1 45,X 胎兒 12 例 45,X 胎兒中，8 例為超聲異常，均為早孕期篩查異常，包括單純NT 增厚3例、頸部水囊瘤3 例、胎兒全身水腫2 例，4 例為無創DNA 異常。 16 例嵌合體胎兒中，1 例為孕婦高齡，1 例為唐篩18 三體高危，2 例為超聲異常，包括NT 增厚1 例、雙側馬蹄足內翻1 例，12 例為無創DNA 異常。 詳細分布情況見表2。

2.2.2 47,XXY 胎兒 28 例 47,XXY 胎兒中，2 例為超聲異常，包括 NT 增厚 1 例、單臍動脈 1 例，26 例為無創DNA 異常。 2 例嵌合體胎兒均為無創DNA異常。

2.2.3 47,XXX 胎兒 12 例 47,XXX 胎兒中，1 例為超聲提示鼻骨發育不良和左心室強光點，11 例為無創DNA 提示性染色體異常。 1 例嵌合體胎兒為無創DNA 異常。此外，還有 1 例 48,XXXX 胎兒，為無創DNA 異常。

2.2.4 47,XYY 胎兒 21 例 47,XYY 胎兒中，1 例為唐篩21 三體高危，20 例為無創DNA 異常。 此外，還有 2 例 47,X, inv (Y)(p11q11) ,inv (Y)(p11q11)胎兒，均為無創DNA 異常。

2.2.5 Y 染色體結構異常胎兒 12 例 inv(Y)(p11q11) 胎兒中，2 例為孕婦高齡，1 例為唐篩高危，4 例為超聲異常，包括NT 增厚3 例、臍膨出1例，2 例為無創異常， 包括21 三體高風險 1 例，3例為不良孕產史。 46,X,Yqh-胎兒4 例，46,X,Yqh+胎兒 1 例，46,X,Yqs 胎兒 1 例。 46,X,psu idic(Y)(p11.3)胎兒1 例，其父親染色體為47,XYY。

2.2.6 X 染色體片段缺失胎兒 46,X,del (X)(p22.3)胎兒1 例， 超聲提示右鎖骨下動脈迷走，CMA：Xp22.33p22.31×1。 46,X,del(X)(p11.2p21.1)胎兒 1例，其母親染色體核型為46,X,del(X)(p22.1)。 46,X,del (X)(q22q26) 胎兒 1 例， 為無創 DNA 異常。Xp22.31 微缺失 2 例，均為唐篩高危。 Xp26.2 微缺失胎兒1 例，夫婦為地貧攜帶者。

2.2.7 X 染色體片段重復胎兒 Xp22.31 微重復胎兒 13 例，5 例為唐篩高危，7 例為超聲異常,分別有NT 增厚、鼻骨未顯示、馬蹄內翻足、室缺、室缺合并永存左上腔、單臍動脈合并左心室強光點、唇裂合并脈絡膜囊腫，1 例為父親染色體平衡易位。 46,X,add(X)(p22.1) 1 例,為無創 DNA 異常。 Xq28 微重復1 例，為無創 DNA 異常。 Xq12 微重復 1 例，為唐篩高危。

3 討論

性染色體異常包括性染色體數目異常和結構異常。性染色體非整倍體(sex chromosome aneuploidies, SCAs)為性染色體數目異常的主要類型,胎兒發生率約1/435[8],出生后發生率接近1/400[9]。 臨床最常見的 SCAs 分別為 45,X、47,XXY、47,XXX 及47,XYY[10]。本組3591 名產前篩查高危孕婦中,共檢出137 胎性染色體異常胎兒,總陽性率3.81%,其中SCAs 95 例，陽性率 2.64%，與 Allanah 等[11]報道的2.93%相似， 陽性率由高到低依次為47,XXY 、47,XYY、45,X 和 47,XXX 等。

表2 137例性染色體異常胎兒分類情況

近年無創DNA 篩查技術的普及是性染色體異常檢出率升高的主要原因之一,該技術對21-三體、18-三體、13-三體具有較高的敏感度和特異性，其準確性隨著技術的發展不斷提升[12]。 但用于SCAs 時準確性差別較大， 陽性預測值在48.4%-54.5%之間[13-15]。 對 45,X、47,XXX、47,XXY、47,XYY的陽性預測值分別為 29%-38%、83%-100%、77%-83%和 83%-100%[14,16]。 本研究中無創 DNA 性染色體異常總體陽性預測值為51.85%(84/162)，與文獻報道的范圍相符，提示其有效性。 在檢測性染色體時，錯誤的結果可能既有生物學上的原因，也有技術上的原因。 除了常見的限制胎盤嵌合(CPM)、母體染色體嵌合、母體拷貝數變異、母體腫瘤、雙胎之一消失外[17]。 X 和Y 染色體存在較多同源基因， 以及測序長度較短時容易引起定位錯誤從而導致假陽性率過高[18,19]。 此外，X 染色體中的 GC 含量偏移，需在實踐中糾正GC 偏倚或從染色體內部有效控制Z 值[20,21]。 對SCAs 的檢出率可能隨孕婦年齡增加而提高[22]。

在 12 例45,X 胎兒中，8 例為早期超聲發現NT 增厚、頸部水囊瘤和全身水腫。病理上均考慮與頸淋巴回流障礙有關， 提示X 單體潛在的致病機制。 多項研究發現Turner 綜合征與相關胎兒頸部水囊瘤,可應用早孕期超聲檢查提高檢出率[23-25]。而16 例 45,X 嵌合體胎兒中，僅 1 例為 NT 增厚，核型為 45,X[43]/47,XXX[7]，CNV-seq 提示 X 單體嵌合約66%，在本組中嵌合比例較高，提示嵌合體的表型與異常細胞系比例存在相關性， 比例越高的臨床表現越明顯，超聲的陽性率越高。

染色體嵌合在產前診斷中普遍存在， 可分為真性嵌合和假性嵌合。 真性嵌合一般指整個胎兒含有兩種或以上的細胞系， 形成機制為細胞分化發生之前的有絲分裂錯誤， 假性嵌合指細胞嵌合僅發生在機體某一個局限的區域，如腦、胎盤和生殖腺等。 由于孕中期羊水細胞來源多樣化，可來源于胎兒、胎盤、羊膜、母體細胞等，假性嵌合可能性高，而孕中后期臍帶血細胞來自于中胚層，在一定程度上更接近于真性嵌合。 本研究中，孕中期羊水細胞性染色體嵌合發生率為0.59%，孕中后期臍靜脈穿刺檢測的性染色體嵌合發生率為 0.17%，其差異可能與真假性嵌合有關。 本次研究中有19 例為性染色體異常嵌合體， 其中15 例為無創DNA 檢出，提示無創DNA 篩查對性染色體嵌合體檢出也有一定作用。 理論上嵌合體的表型與異常細胞系的比例有關， 但性染色體嵌合患者的臨床表現變異較大，臨床癥狀與異常核型比例不盡相同，如體細胞嵌合和X 染色體失活等[26]。因此通常需要應用多種檢測技術如 FISH、CMA 等方法， 同時結合超聲檢查進行綜合評估， 在遺傳咨詢中充分告知孕婦及家屬各種檢測技術的局限性和核型與表型的不一致性，以及胎兒性腺發育的特殊性。 性染色體異常胎兒的預后有時較難評估，需隨訪至青春期。

CNVs 是由染色體發生重排而導致的染色體亞顯微水平的微缺失和微重復， 屬于結構變異的一種。傳統的核型分析已不能滿足對CNVs 檢測的需求， 本研究通過CMA/CNV-seq 技術在18 例核型分析正常的胎兒中檢出染色體微缺失/微重復，陽性率提高0.5%。其中7 例為超聲異常，提示對胎兒超聲異常的孕婦進行產前診斷時加做CNVs 檢測的必要性。 同時對4 例核型結構異常的胎兒進行了更精確的定位和致病性判讀， 進一步協助遺傳咨詢。 其中一例為無創DNA 提示性染色體增加，核型分析為 46,X,add(X)(p22.1)，FISH 檢測發現Y 染色體信號，而CMA 結果顯示X 染色體拷貝數為 2、Y 染色體拷貝數為 1， 考慮為特殊形式的Klinefelter 綜合癥。 本研究中無創異常組中CNVs的檢出率較低，考慮與測序深度有關。 有關研究顯示，NIPT 的檢測能力主要由胎兒 DNA 濃度和CNV 大小決定，在不增加測序深度的前提下，胎兒CNVs > 5 Mb 時才具有較高的靈敏度[27]。

總之，無創DNA 檢測以及產前超聲篩查的應用對于胎兒性染色體異常的檢出具有有重要價值， 把握適應癥的同時充分運用多種遺傳學檢測技術可以有效提高產前診斷陽性率， 并對進一步的遺傳咨詢提供精確指導。