鹿角壯骨膠囊對木瓜蛋白酶致兔膝骨關節(jié)炎模型軟骨形態(tài)及軟骨細胞微結構的影響

梁子聰，王恒，覃建鋒，黎子陽，林浩恒，熊冬明，胡建山，江勇，陸瑞娜，劉運麟

（1.黔南民族醫(yī)學高等專科學校，貴州 都勻；2.三都愛善醫(yī)院，貴州 黔南；3.黔南州中醫(yī)醫(yī)院，貴州 都勻；4.黔南州人民醫(yī)院，貴州 都勻）

0 引言

膝骨關節(jié)炎（Knee Osteoarthritis, KOA）是一種以膝關節(jié)軟骨與滑膜的退行性變?yōu)樘卣鞯穆赃M行性骨關節(jié)病。傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療膝骨關節(jié)炎具有治療費用低、效果良好等優(yōu)勢。

鹿角壯骨膠囊為黔南州中醫(yī)醫(yī)院的院內制劑，具有補肝益腎，強筋壯骨的作用，臨床上對KOA患者有較好的治療效果[1]。本實驗以木瓜蛋白酶建立兔右膝關節(jié)炎模型，觀察鹿角壯骨膠囊對軟骨形態(tài)及軟骨細胞微結構的影響，以觀察其對膝骨關節(jié)炎的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器

ASP300 S型全封閉式組織脫水機、RM2265型全自動輪轉式切片機、HI1210型攤片機、DM750型光學顯微鏡（德國Leica）；透射電子顯微鏡（日本電子公司）。

1.2 試劑與藥品

L-半胱氨酸、木瓜蛋白酶（北京索萊寶），4%多聚甲醛、3%戊二醛、蘇木素-伊紅（Hematoxylin and Eosin, HE）染液、乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic Acid, EDTA）脫鈣液由黔南州人民醫(yī)院病理科提供，其余試劑均為國產分析純。鹿角壯骨膠囊由黔南州中醫(yī)醫(yī)院制劑科提供（批準文號：黔藥制2013003號，規(guī)格：0.45 g/粒）。

1.3 實驗動物與分組

普通級四月齡日本長耳白兔24只，♀，體重（2.0±0.5）kg，由長沙天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2014-0010。24只兔隨機分為三組，分別為正常組、模型組、治療組（鹿角壯骨膠囊），每組8只。各組長耳兔均適應性飼養(yǎng)1周。

2 方法

2.1 木瓜蛋白酶溶液的配制

參考文獻方法，在無菌條件下將L-半胱氨酸與滅菌生理鹽水配成濃度0.03 mol/L，將木瓜蛋白酶與滅菌生理鹽水配成4%濃度，4 ℃冷藏備用。注射前0.5 h，將配制好的L-半胱氨酸與木瓜蛋白酶按1:2的比例混勻待用。

2.2 兔膝關節(jié)炎造模的建立及給藥

各組兔按3.5 mL/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，待完全麻醉后，剪刀于右側膝關節(jié)內側附近備皮，顯露皮膚，碘伏、75%酒精棉簽反復消毒。1 mL注射器抽取提前配制好的4%木瓜蛋白酶溶液0.5 mL，微微彎曲膝關節(jié)，針尖分別在模型組與治療組兔內側膝眼進針，回抽確定進入關節(jié)腔后，緩慢注射，棉簽輕壓針眼，避免溶液溢出。正常組同法注射等體積滅菌注射用水。各組被動屈伸右側膝關節(jié)20次，促進溶液在關節(jié)腔內均勻擴散。間隔3 d重復1次，共注射3次。末次注射后，各組兔每天驅趕運動30 min，其余時間籠內自由活動。首次注射后第2周，治療組給予鹿角壯骨膠囊藥粉0.3 g·kg-1（參照成人和實驗動物等效劑量換算而得）[2]，稱取體重的相應劑量，用蒸餾水稀釋成10 mL后灌胃，每天1次，連續(xù)給藥4周。余組給予10 mL蒸餾水灌胃。

2.3 動物取材

末次給藥第2天，麻醉處死所有實驗動物。膝關節(jié)周圍備皮，戴口罩、無菌手套，切開關節(jié)囊，取下膝關節(jié)右側股骨遠端骨組織，置于4%多聚甲醛中固定。

2.4 標本觀察

2.4.1 關節(jié)面軟骨的肉眼形態(tài)觀察

剪除各組兔右側膝關節(jié)軟組織后，打開關節(jié)囊，暴露關節(jié)面，觀察右側股骨關節(jié)面軟骨的肉眼病理形態(tài)，并對關節(jié)面軟骨平整度，色澤和軟骨缺損進行評價。

2.4.2 關節(jié)面軟骨的光學顯微鏡觀察

取下各組兔右側膝關節(jié)股骨遠端標本，置于4%多聚甲醛溶液中固定2 d，10%EDTA脫鈣2周，大量自來水沖洗，石蠟包埋（大小約1 cm×1 cm×0.4 cm），切片（厚度約5 μm），HE染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察股骨軟骨面形態(tài)。

2.4.3 軟骨細胞微結構的透射電鏡觀察

將軟骨組織切成大小約1 mm×1 mm×1 mm，3%的戊二醛溶液固定2 h；脫鈣浸泡3周，每周換液1次，PBS緩沖液漂洗2次，1%四氧化鋨固定1 h，80%、95%乙醇脫水各15 min，放入無水乙醇洗2次；環(huán)氧樹脂包埋，聚合，切片70 nm，用枸櫞酸鉛和醋酸鈾染色，透射電鏡觀察軟骨細胞微結構。

3 結果

3.1 各組兔關節(jié)面軟骨的肉眼形態(tài)觀察結果

正常組兔右側膝關節(jié)面軟骨光滑平整，色澤正常，未見軟骨缺損；模型組兔右側膝關節(jié)面軟骨明細變薄、極度不平整，有潰瘍形成，缺損深達軟骨深層，甚至軟骨剝脫，軟骨下骨硬化；治療組兔右側膝關節(jié)面軟骨變薄、欠平整，局部關節(jié)面見糜爛、潰瘍存在，深達軟骨表層至中層。與模型組比較，治療組軟骨面破壞情況有所減輕，見圖1。

圖1 各組兔膝關節(jié)面軟骨肉眼形態(tài)觀察

3.2 各組兔關節(jié)面軟骨的光學顯微鏡觀察結果

正常組見關節(jié)面軟骨光滑平整，軟骨細胞正常，軟骨基質無明顯減少，潮線完整；模型組見關節(jié)軟骨層潰瘍，深達軟骨下層，軟骨細胞及軟骨基質明顯減少，潮線不完整；治療組見關節(jié)軟骨層糜爛甚至潰瘍，軟骨細胞及軟骨基質減少，潮線欠完整。與模型組比較，治療組軟骨基質及軟骨細胞減少不明顯，見圖2。

圖2 各組兔膝關節(jié)面軟骨鏡下形態(tài)觀察結果（HE，×200）

3.3 各組兔軟骨細胞微結構的透射電鏡觀察結果

正常組見軟骨細胞膜完整，細胞表面有微絨毛突起，細胞核完整，核膜清晰，染色質均勻，胞質內見豐富的粗面內質網(wǎng)、線粒體及高爾基復合體。模型組見軟骨細胞膜腫脹明顯，細胞核固縮，胞質內見大量脂滴，線粒體基本消失，粗面內質網(wǎng)斷裂溶解。治療組見軟骨細胞膜欠完整，細胞核核膜腫脹，染色質不均勻，胞質內見多量脂滴，部分線粒體消失及粗面內質網(wǎng)斷裂溶解。與模型組比較，治療組兔軟骨細胞膜及細胞器破壞較輕，細胞功能丟失不明顯，見圖3。

圖3 各組兔軟骨細胞微結構的透射電鏡觀察結果（TEM，×20 000）

4 討論

采用木瓜蛋白酶關節(jié)腔內注射誘發(fā)骨關節(jié)炎是一種常用的造模方法。木瓜蛋白酶可分解軟骨基質中蛋白多糖，減弱軟骨基質對軟骨細胞的保護作用，導致軟骨細胞變性、壞死；被分解的軟骨碎屑脫離至關節(jié)腔中，刺激滑膜大量分泌炎性遞質及氧自由基，引起無菌炎癥反應，加速關節(jié)退變[4]。本研究結果顯示，模型組兔右側膝肉眼觀察見關節(jié)面軟骨明細變薄、極度不平整，有潰瘍形成，缺損深達軟骨深層，甚至軟骨剝脫，軟骨下骨硬化，光鏡觀察見軟骨細胞及軟骨基質明顯減少，潮線不完整；電鏡觀察見軟骨細胞膜腫脹明顯，細胞核固縮，胞質內見大量脂滴，線粒體基本消失，粗面內質網(wǎng)斷裂溶解。與文獻描述中，木瓜蛋白酶致膝骨關節(jié)炎表現(xiàn)基本一致。

膝骨關節(jié)炎屬中醫(yī)學“痹癥之膝痹”的范疇。中醫(yī)學認為膝骨關節(jié)炎與“外邪”“內虛”“血瘀”等病因關系密切。人隨著年齡增大，肝腎精氣漸枯，筋骨失去濡養(yǎng)，復感風寒濕之邪而發(fā)病，或年少外傷，瘀血阻塞經(jīng)絡所致[5]。鹿角壯骨膠囊是我院名老中醫(yī)根據(jù)民族醫(yī)藥理論提出的組方，方中選取溫腎助陽之鹿角霜、巴戟天為君藥；配伍以枸杞、補骨脂補肝益腎，炙黃芪升陽補氣，共為臣藥；佐以熟地黃、骨碎補、川芎增強君、臣藥填精益髓，補益肝腎之功。諸藥共奏補益肝腎、強筋壯骨之功效。前期研究證實鹿角壯骨膠囊能降低膝骨關節(jié)炎患者血清白介素1β、腫瘤壞死因子α、金屬基質蛋白酶3，達到減輕疼痛及改善臨床癥狀[6]。本研究結果可見，鹿角壯骨膠囊治療組兔膝關節(jié)軟骨面、軟骨基質、軟骨細胞的破壞與壞死均比模型組有所減輕，證實鹿角壯骨膠囊對兔膝關節(jié)軟骨基質及軟骨細胞具有保護作用。其作用機制可能與減輕木瓜蛋白酶致膝骨關節(jié)炎炎癥反應相關。

綜上所述，鹿角壯骨膠囊對木瓜蛋白酶致兔膝骨關節(jié)炎模型具有保護作用，其機制可能與減輕木瓜蛋白酶致膝骨關節(jié)炎炎癥反應相關。但其作用于某一或多個信號通路以減輕炎性遞質釋放，尚需進一步實驗探討。