牛糞酵母菌的分離鑒定及其碳源代謝分析

鄒光進 謝紅煉 汪漢成 劉暢 黃宇 陳乾麗

摘要：牛糞中的酵母菌是重要的資源，在牛糞發酵的過程中具有重要作用。為了分離、鑒定牛糞中可培養的酵母菌，并研究其碳源代謝指紋圖譜，以發酵牛糞為材料，采用稀釋涂布平板法分離牛糞中的酵母菌，經菌落觀察和鏡檢后，采用Biolog全自動微生物鑒定系統對分離菌株進行鑒定。結果表明，從發酵牛糞中共分離得到7株酵母菌，并且鑒定到了種水平，其中有3株為白吉利毛孢子菌（Trichosporon beigelii），2株為約翰遜鎖擲孢酵母（Sporidiobolus johnsonii），1株為菱形伊薩酵母（Issatchenkia scutulata），1株為隱球酵母屬的Cryptococcus tsukubaensis。分離得到的4種酵母菌的碳源代謝能力和同化能力存在差異，Trichosporon beigelii能夠利用的碳源種類最多，具有較強的環境適應性，其次為Issatchenkia scutulata、Sporidiobolus johnsonii、Cryptococcus tsukubaensis;糊精是能被大部分酵母菌代謝的唯一碳源。牛糞中酵母菌代謝的特征性碳源信息及優勢酵母菌菌株對于牛糞的快速腐熟堆肥具有一定的指導意義。

關鍵詞：牛糞;酵母菌;Biolog微生物自動鑒定系統;鑒定

中圖分類號： S182? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0305-05

牛糞自古以來都是農作物的一種高效的有機肥，它養分全、肥效期長，所含微生物能夠促進植物對根際營養的吸收;牛糞還能夠減少土壤中養分的固定，提高化肥的肥效，也可以調節土壤理化性狀，改善土壤結構[1]。此外，牛糞還作為飼料原料出現在各種動物飼料中。研究發現，新鮮牛糞中含有22.56%干物質、3.10%粗蛋白、0.37%粗脂肪、9.84% 粗纖維、5.18%無氮浸出物、0.32%鈣、0.08% 磷;發酵后的牛糞具有酵母的特殊氣味，粗蛋白、粗脂肪含量分別增加了27.3%、5.1%，粗纖維含量減少，含有較多的營養物質[2-3]。從牛糞中挖掘優良酵母菌并加以開發利用，對于牛糞在植物肥料和飼料原料方面的應用具有重要意義。目前，尚無牛糞中酵母菌分離與鑒定的報道。

基于形態特征、生理學特性等傳統的酵母菌鑒定方法耗時費力，且操作不方便[4]。近年來，酵母菌快速鑒定系統不斷更新換代，出現了如API20C AUX、ATB32C、Vitek YBC和API Candid等系統[5-6]。由于這些鑒定系統主要應用于臨床酵母菌的鑒定，因此針對性較強，但是能鑒定的酵母菌種類有限。目前，由美國Biolog公司開發的Biolog全自動微生物分析系統已經能鑒定52個屬、267個種酵母菌，并且該系統能與計算機軟件連用進行數據分析，自動化和標準化程度高，鑒定速度快[7-8]，因而該系統在國際上常用于酵母菌的分類鑒定[9-10]。本研究旨在使用Biolog微生物全自動分析系統對腐熟牛糞中的優勢酵母菌進行分離鑒定，并根據酵母菌在Biolog YT微孔板上的表型對其碳代謝特征進行初步研究，以期在微生物種類方面為商品牛糞和牛糞飼料的工業化開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為充分腐熟的牛糞，采自奶牛場，經自然發酵獲得。BUY培養基，購自美國Biolog公司。配制時稱取60 g BUY培養基，加入1 000 mL蒸餾水中，加熱攪拌溶解，待自然冷卻后調節pH值至5.6左右，于1×105 Pa條件下高壓蒸汽滅菌 20 min，倒制平板、備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌的分離、純化 稱取5 g牛糞，加入裝有50 mL無菌水和適量玻璃珠的錐形瓶中，在 26 ℃、黑暗、轉速為130 r/min的條件下振蕩培養30 min，取上清液進行稀釋，依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7系列濃度梯度的菌懸液。分別取100 μL不同濃度的菌懸液進行涂布，每個濃度設3個重復，將平板置于26 ℃黑暗條件下培養，48 h 后根據菌落形態特征及鏡檢形態特征對酵母菌進行初步鑒定。將菌株于BUY平板純化后接種于BUY斜面上，并于4 ℃低溫保存。

1.2.2 酵母菌的鑒定 將經過純化后的酵母菌采用BUY平板轉接2代，置于26 ℃黑暗條件下培養48 h。將保存于4 ℃條件下的Biolog YT微孔鑒定板（圖1）和裝有無菌水的濁度管從冰箱中取出，使其自然恢復至室溫。調節濁度儀，使其在關機狀態下的讀數為0;開機后，使其測量無菌水的讀數為100%，測量YT濁度標準管的讀數為47%。用無菌水潤濕Biolog專用棉簽后蘸取新鮮菌體，沿著接種液管內壁使菌體附著于內壁上，并傾斜接種液管使菌體在接種液中混合均勻，通過向接種液中加入無菌水或者菌體來調節其濁度，使最終濁度為（47±3）%。將制備好的加菌接種液倒入無菌加樣槽中，用8頭移液器將接種液分別加至YT鑒定板的各孔內，每孔100 μL。將鑒定板置于無菌、保濕的自封袋中，于26 ℃黑暗條件下培養。分別在培養24、48、72 h時，將鑒定板放置于Biolog全自動微生物鑒定系統中進行鑒定，采用MicroLog 3軟件讀取數據，并與數據庫中的數據進行自動化比對，得到4個最大匹配度的菌種名稱，獲得酵母菌的鑒定結果。

1.2.3 酵母菌的表型代謝分析 酵母菌于微孔板中培養72 h后，觀察酵母菌在YT微孔板中的代謝反應，從而得出各種酵母菌的碳源代謝情況，隨后進行碳源代謝特征的分析。

2 結果與分析

2.1 牛糞酵母菌的分離

利用涂布稀釋法從發酵牛糞中分離得到了酵母菌，通過觀察發現，高濃度（10-2、10-3）稀釋液培養基上長出的菌落較多，10-4、10-5和10-6低濃度稀釋液培養基上鮮有酵母菌長出。挑取不同性狀、顏色和生長速度的7株酵母進行純化培養，并依次編號為NF-1、NF-2、NF-3、NF-4、NF-5、NF-6和NF-7。

2.2 牛糞酵母菌的鑒定

用Biolog MicroLog 3軟件讀取96孔微孔板的濁度，并與數據庫中的數據進行匹配，得到4個匹配度最高的酵母菌種類，結果中包括3個參數，即可能性（probability，簡稱PROB）、相似性（similarity，簡稱SIM）和位距（distance，簡稱DIS），其中PROB表示鑒定結果的可能性大小，SIM表示讀取的數據與數據庫中數據的匹配程度。酵母菌在培養24 h時，SIM應≥0.75，在培養48、72 h時，SIM應≥0.50。當DIST≤5.0、SIM越接近1.00時，鑒定結果的準確度越高。如表1所示，7株酵母菌在Biolog YT板中培養48 h后得到了準確鑒定，其中有3株為白吉利毛孢子菌（Trichosporon beigelii），2株為約翰遜鎖擲孢酵母（Sporidiobolus johnsonii），1株為菱形伊薩酵母（Issatchenkia scutulata），1株為隱球酵母屬的Cryptococcus tsukubaensis。

2.3 牛糞酵母菌的碳源代謝特征分析

96孔微孔鑒定板含有多種脫水碳源，Biolog酵母菌全自動鑒定系統通過在96孔微孔板中培養酵母菌，使其發生氧化還原反應和同化反應，圖1中 A～C行的結果基于顯色反應原理，D～H行的結果基于反應濁度差異原理。當酵母菌利用微孔中的碳源時，A～C行孔內的四唑紫染色劑會由無色被還原成紫色;當酵母菌同化D～H行微孔中的碳源時，相應微孔中的濁度會增加。因此，用Biolog YT微孔板鑒定可以得到酵母菌碳源代謝的特征性“指紋圖譜”。

Trichosporon beigelii、Sporidiobolus johnsonii、Issatchenkia scutulata和Cryptococcus tsukubaensis在Biolog YT微孔板上的鑒定結果見圖2。可以看出，Trichosporon beigelii代謝的碳源種類最多，有25種，主要包括α-D-葡萄糖酸、L-谷氨酸、琥珀酸、L-天冬氨酸和甲酸等，不能代謝的碳源有7種，處于代謝邊界值的有4種;Cryptococcus tsukubaensis可以代謝的碳源數量次之，有3種，包括糊精、蔗糖和水楊苷，不能代謝的碳源有11種，處于代謝邊界值的有22種;Sporidiobolus johnsonii能代謝的碳源僅有糊精、α-D-葡萄糖2種碳源，不能代謝的碳源有19種，處于代謝邊界值的有15種;Issatchenkia scutulata不能代謝的碳源有23種，處于代謝邊界值的有13種。

此外，4種酵母菌對碳源的同化能力有較大差異，其中Trichosporon beigelii可以同化的碳源種類最多（24種），主要包括L-蘋果酸、D-葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸、L-谷氨酸、D-松三糖、反丁烯二酸等，不能同化的碳源有8種，處于邊界值的有28種;Issatchenkia scutulata可以同化的碳源有14種，主要包括L-阿拉伯糖、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-海藻糖、蔗糖、L-蘋果酸、糊精+D-木糖等，不能同化的碳源有33種，處于邊界值的有13種;Sporidiobolus johnsonii可以同化的碳源有14種，主要包括熊果苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺、糊精、蔗糖、糊精+D-木糖、D-海藻糖等，不能同化的碳源有34種，處于邊界值的有12種;Cryptococcus tsukubaensis可以同化的碳源有13種，主要包括反丁烯二酸、L-蘋果酸、龍膽二糖、麥芽糖、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、α-D-葡萄糖、糊精等，不能同化的碳源有27種，處于邊界值的有20種。

3 討論

酵母菌為單細胞真菌，主要由擔子菌亞門、子囊菌亞門真菌組成。傳統的酵母菌鑒定方法包括形態學特征及生理生化測試等，但程序繁瑣，工作量大。基于26S rDNA的D1/D2區和內轉錄間隔區（ITS）序列是目前酵母菌分子鑒定常用的比對目標，雖然可以鑒定大部分酵母菌，但這些區域數據庫目前仍在發展完善中，許多酵母菌的種間差異仍不能夠完全區分[11]。基于碳代謝機制的Biolog微生物鑒定技術可以彌補這一不足，然而Biolog酵母菌鑒定板僅能鑒定其數據庫中包含的酵母菌，而不能鑒定Biolog全自動鑒定系統數據庫中沒有的酵母菌種類，因此該數據庫還有待進一步完善和補充[12]。在今后的研究中，Biolog微生物自動鑒定系統可與PCR檢測結果互相驗證，互為補充[13]。本研究首次采用Biolog微生物鑒定系統對牛糞中可培養酵母菌進行了鑒定研究，為牛糞酵母菌的資源化開發奠定了基礎。

目前，酵母菌已被廣泛應用于食品生產、釀酒工業、飼料等多個領域。發酵是酵母菌的主要功能之一，它可以縮短饅頭、面包等的發酵時間，還能釀造出醬、醋、葡萄酒、飲料等多種產品，酵母菌還可以作為飼料添加物用于家畜飼料生產。隨著我國有機（類）肥料的發展，肥料微生物的研究與應用越來越被重視，報道較多的有細菌、放線菌和真菌，而很少有酵母菌相關的報道，特別是關于家畜糞便及其堆肥中酵母菌的研究。吳媛等于2011年報道，鴿糞中的酵母菌主要有隱球酵母菌（Cryptococcus）、紅酵母菌（Rhodotorula）、線黑粉酵母菌（Filobasidium）、假絲酵母菌（Candida）、漢斯德巴氏酵母菌（Debaryomyces hansenii）和釀酒酵母菌（Saccharomyces）[14]。本研究首次分離了腐熟牛糞中的酵母菌，獲得的酵母菌與上述酵母菌均不相同，這可能與牛糞特殊的營養載體及其所處環境有關。本研究中的Trichosporon beigelii和Sporidiobolus johnsonii在腐熟牛糞中占有一定優勢，它們可能是牛糞中的優勢酵母菌。至于4種牛糞中的酵母菌在牛糞腐熟、發酵過程中起什么作用、其種群變化趨勢等方面還值得進一步研究。

選取4株酵母菌進行Biolog碳源利用分析發現，糊精能被所有酵母菌株利用，說明它是牛糞酵母菌的“喜好”性碳源，這可為分離、培養牛糞酵母菌的培養基設計提供依據。本研究發現，白吉利毛孢子菌的代謝碳源種類豐富，有L-蘋果酸、D-葡萄糖酸、糊精、反丁烯二酸、龍膽二糖等25種，充分表明該酵母菌具有較強的環境適應性，具有用于生物有機肥開發利用的潛力;C. tsukubaensis、約翰遜鎖擲孢酵母和伊薩酵母代謝碳源種類較少，這種差異與菌株的代謝能力受到生存環境的密切影響相關。此外文獻檢索結果表明，本研究所得4種牛糞酵母菌均屬于非致病性微生物，安全風險低。

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收稿日期：2020-01-20

基金項目：中國博士后科學基金（編號：2017M610585）;中國煙草總公司科技項目[編號：110202001035（LS-04）];貴州省科技廳優秀青年人才培養計劃（編號：黔科合平臺人才[2017]5619）;中國煙草總公司貴州省公司科技項目（編號：201711、201714、201914）。

作者簡介：鄒光進（1968—），男，貴州黔東南人，農藝師，主要從事煙草生長管理方面的工作，E-mail：zouguangjin1@163.com;共同第一作者：謝紅煉（1996—），女，湖北黃岡人，碩士研究生，主要研究方向為植物保護學，E-mail：xiehonglian0901@163.com。

通信作者：汪漢成，博士，研究員，主要從事煙草植物保護學方面的工作。E-mail：xiaobaiyang126@hotmail.com。