水稻組氨酸磷酸轉運蛋白OsAHP2的表達及純化

孫麗靜,李倩影,王培楠,孫 穎

(1.河北省農林科學院 糧油作物研究所,河北省作物遺傳育種實驗室,河北 石家莊 050035；2.河北師范大學 生命科學學院,分子細胞生物學教育部重點實驗室,河北 石家莊 050024)

細胞分裂素是一類重要的植物激素,在細胞分裂、芽的分化、葉綠素合成、葉片衰老、種子發育等生長發育過程[1-6]和應對鹽漬、干旱、冷脅迫、營養脅迫等非生物脅迫的過程中[7-12],均發揮著重要作用。

組氨酸磷酸轉運蛋白(Histidine phosphotransfer proteins, HPs)是細胞分裂素信號轉導通路的重要組成部分。HP上保守的組氨酸位點接受來自細胞分裂素受體(Histidine kinases, HKs)的磷酸基團后,從細胞質進入細胞核,隨后將磷酸基團轉移到定位于細胞核的反應調節因子(Response regulators, RRs)上,從而激活下游基因的表達以完成信號傳遞[4,13-15]。

擬南芥中有5個含有保守組氨酸位點的AHP,單突變體和雙突變體在細胞分裂素的響應上沒有缺陷,然而,ahp1,2,3在根的生長、葉綠素合成、下胚軸伸長等方面對細胞分裂素不敏感,表明AHP是細胞分裂素信號轉導途徑的正調節因子,并且AHP之間存在功能冗余現象[16]。ahp1,2,3,4,5則展現出主根變短、育性降低、種子增大等表型[16]。此外,研究表明,ahp2,3,5具有很強的耐鹽性和抗旱性,暗示擬南芥AHP2、AHP3、AHP5作為重要的負調節因子參與了植物對鹽和干旱脅迫的應激反應[17]。

水稻中只有2個含有保守組氨酸位點的組氨酸磷酸轉運蛋白,OsAHP1和OsAHP2[18-20]。分子細胞生物學教育部重點實驗室前期通過RNA干擾的方法同時降低了轉基因植株中OsAHP1和OsAHP2的表達,OsAHP-RNAi植株表現出細胞分裂素信號轉導缺陷表型,包括矮化、側根生長增加、葉片提早衰老、分蘗數減少和育性下降等,并對外源細胞分裂素不敏感[21]。此外,OsAHP-RNAi幼苗對鹽脅迫處理表現超敏感表型,但是對干旱脅迫表現出抗逆表型[21]。這些結果表明,OsAHP在細胞分裂素信號轉導中起著正調節因子的作用,并且在水稻鹽和干旱脅迫中發揮著不同的作用。

本研究構建了2個OsAHP2原核表達載體,通過比較篩選出融合蛋白表達量較高的pET-32a-OsAHP2進行后續試驗,優化了蛋白表達條件并對表達的融合蛋白進行了分離純化,為后續研究OsAHP2與細胞分裂素信號轉導通路中其他蛋白的相互作用和磷酸化分析奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、Rosseta、XA90、水稻日本晴(Oryzasativassp.Japonica)、表達載體pET-32a、pGEX-4T-1為河北師范大學生命科學學院分子細胞生物學教育部重點實驗室保存；質粒提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司；RNA提取試劑購自Invitrogen公司；RNA反轉錄試劑盒、PCR所用Taq酶、限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；His純化基質購自Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1OsAHP2基因的克隆及原核表達載體的構建 利用TRIzol提取10 d水稻葉片總RNA,以1 μg RNA為模板,按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒說明書反轉錄合成cDNA。根據NCBI數據庫公布的基因序列(Os09g39400),設計OsAHP2基因特異引物,上游引物OsAHP2-F: 5′-CGGAATTCATGGCGGCCGCCGCTCTCCG-3′,下游引物OsAHP2-R:5′-CCCTCGAGTGCACACGCGCACACACTCT-3′,以水稻cDNA為模板進行PCR擴增,將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳后膠回收。將PCR產物與空載體pET-32a和pGEX-4T-1分別進行EcoRⅠ和XhoⅠ酶切連接后轉化大腸桿菌DH5α,重組子經菌體PCR和酶切鑒定正確后,送生工生物工程(上海)有限公司測序。將測序正確的重組質粒pET-32a-OsAHP2轉化大腸桿菌表達菌株Rosseta,pGEX-4T-1-OsAHP2轉化大腸桿菌表達菌株XA90。

1.2.2 誘導表達時間的優化 將重組菌pET-32a-OsAHP2(Rosseta)和pGEX-4T-1-OsAHP2(XA90)分別接種于LB培養基(100 mg/L Amp),37 ℃ 220 r/min振蕩培養12 h,按1∶50比例擴培后培養至OD600為0.6～0.8,加入IPTG(終濃度0.5 mmol/L),30 ℃誘導0,1,3,5 h,分別離心收集菌體,進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.3 融合蛋白的可溶性分析 按方法1.2.2優化的結果,將重組菌pET-32a-OsAHP2(Rosseta)30 ℃ 220 r/min誘導3 h,離心收集菌體,用1/10體積的溶菌液(25 mmol/L Tris(pH值8.0),300 mmol/L NaCl,1 mmol/L DTT,1 g/L溶菌酶,0.2 mmol/L PMSF)重懸菌體,冰上靜置40 min后超聲破碎至溶液清亮。4 ℃ 12 000 r/min離心30 min收集上清和沉淀,進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 融合蛋白的純化 按方法1.2.3中所述,收集超聲后上清,用0.45 μm濾膜過濾,用3倍體積的平衡液(25 mmol/L Tris(pH 值8.0),300 mmol/L NaCl,10 mmol/L咪唑)平衡His純化基質,將過濾后的上清與His純化基質于50 mL離心管中4 ℃混勻1 h。用洗滌緩沖液(25 mmol/L Tris(pH值 8.0),300 mmol/L NaCl,40 mmol/L咪唑)沖洗4次,用洗脫緩沖液(25 mmol/L Tris(pH值8.0),300 mmol/L NaCl,200 mmol/L咪唑)洗脫3次,SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白純化效果。

2 結果與分析

2.1 OsAHP2基因的克隆及原核表達載體的構建

利用OsAHP2基因上下游特異引物PCR擴增獲得557 bp(包括ORF 450 bp,編碼149個氨基酸)的OsAHP2全長基因(圖1-A)。為了探索不同表達載體對蛋白表達的影響,分別將OsAHP2基因連接原核表達載體pET-32a和pGEX-4T-1,轉化DH5α。利用載體上游引物和基因下游引物進行菌體PCR鑒定(圖1-B),陽性克隆搖菌提取質粒后進行酶切鑒定(圖1-C),均可得到557 bp的條帶。質粒送公司測序,正確的重組質粒分別命名為pET-32a-OsAHP2和pGEX-4T-1-OsAHP2。

A.OsAHP2的PCR擴增：M.Marker Ⅲ分子量標準；OsAHP2.OsAHP2基因；B. OsAHP2原核表達載體的菌體PCR鑒定：1-4. pET-32a-OsAHP2菌體PCR產物；M.Marker Ⅲ分子量標準；5-8.pGEX-4T-1-OsAHP2菌體PCR產物；C. OsAHP2原核表達載體的酶切鑒定：M. Marker Ⅲ分子量標準；1-2.pET-32a-OsAHP2重組質粒EcoRⅠ+ XhoⅠ雙酶切；3-4.pGEX-4T-1-OsAHP2重組質粒EcoRⅠ+ XhoⅠ雙酶切。

2.2 不同原核表達載體和IPTG誘導時間對融合蛋白表達量的影響

將pET-32a-OsAHP2轉化大腸桿菌表達菌株Rosseta,pGEX-4T-1-OsAHP2轉化大腸桿菌表達菌株XA90,分別用0.5 mmol/L IPTG誘導1,3,5 h后取樣；pET-32a空載體和pGEX-4T-1空載體則分別用0.5 mmol/L IPTG誘導5 h取樣。SDS-PAGE結果表明,pET-32a空載體經IPTG誘導在21 ku處產生誘導條帶,為載體上的Trx+His+S標簽；以未誘導和空載體為對照,pET-32a-OsAHP2重組菌株在35 ku處誘導表達出融合蛋白,并且融合蛋白的表達量3 h最高(圖2-A)。pGEX-4T-1空載體經IPTG誘導在28 ku處產生誘導條帶,為載體上的GST標簽；以未誘導和空載體為對照,pGEX-4T-1-OsAHP2重組菌株在42 ku處誘導表達出融合蛋白,并且融合蛋白的表達量均隨著時間的增加而增多(圖2-B)。

A.IPTG誘導時間與pET-32a-OsAHP2融合蛋白表達量的關系：M.蛋白分子量標準；1.pET-32a空載體未誘導；2.pET-32a空載體IPTG誘導5 h；3.pET-32a-OsAHP2融合蛋白未誘導；4-6.pET-32a-OsAHP2融合蛋白IPTG誘導1,3,5 h；B.IPTG誘導時間與pGEX-4T-1-OsAHP2融合蛋白表達量的關系：M.蛋白分子量標準；1.pGEX-4T-1空載體未誘導；2.pGEX-4T-1空載體IPTG誘導5 h；3.pGEX-4T-1-OsAHP2融合蛋白未誘導；4-6.pGEX-4T-1-OsAHP2融合蛋白IPTG誘導1,3,5 h。

雖然pET-32a-OsAHP2和pGEX-4T-1-OsAHP2均能表達出融合蛋白,但pET-32a-OsAHP2融合蛋白的表達量整體高于pGEX-4T-1-OsAHP2。因此,選擇pET-32a-OsAHP2重組菌株IPTG誘導3 h進行后續蛋白純化。

2.3 pET-32a-OsAHP2融合蛋白的可溶性分析

將pET-32a-OsAHP2重組菌株IPTG誘導3 h的菌體進行超聲波破碎,離心收集上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。結果表明,OsAHP2融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在于菌液裂解后的上清中,包涵體中也有一定量的表達(圖3)。由于可溶性蛋白具有活性、純化簡單等優點,因此,選擇從可溶性蛋白中進行后續蛋白純化。

1.未誘導；2.誘導后全蛋白；3.誘導后裂解上清；4.誘導后裂解沉淀；M.蛋白分子量標準。1.Total protein without IPTG induction; 2.Total protein with IPTG induction; 3.Supernatant of lysate; 4.Precipitation of lysate; M.Protein Marker.

2.4 pET-32a-OsAHP2融合蛋白的純化

將pET-32a-OsAHP2重組菌株IPTG誘導3 h的菌體進行超聲波破碎,離心后的上清用His鎳離子親和層析柱進行蛋白純化,通過4次洗滌和3次洗脫,獲得了大量大小約為35 ku的純度較好的OsAHP2融合蛋白(圖4)。

M.蛋白分子量標準；1.未誘導；2.誘導后全蛋白；3.上柱液；4.流出液；5.第1次洗滌液；6.第4次洗滌液；7-9.洗脫液E1～E3。

3 結論與討論

組氨酸磷酸轉運蛋白是細胞分裂素信號轉導通路的重要組成部分,負責將細胞分裂素受體的磷酸基團轉移到下游的反應調節因子上,從而激活下游基因的表達。水稻中HP家族由2個OsAHP(Authentic His-containing phosphotransfer protein)和3個OsPHP(Pseudo His-containing phosphotransfer proteins)組成[18-20]。OsAHP具有信號轉導過程中用于進行磷酸基團傳遞的保守的His位點；而OsPHP中保守的His位點被Glu替代,因無法進行信號傳遞而被稱為假磷酸轉運蛋白。本實驗室前期研究結果表明,OsAHP參與了水稻細胞分裂素信號轉導途徑,并且在鹽和干旱脅迫中也發揮著重要作用[21]。為了進一步研究OsAHP2與細胞分裂素信號轉導通路中其他蛋白的相互作用和磷酸化分析,本研究構建了OsAHP2原核表達載體,優化了蛋白表達條件并對表達的融合蛋白進行了分離純化。

大腸桿菌表達系統具有培養周期短、遺傳背景清楚、目的基因表達水平高等優點[22-24]。然而,外源基因能否在大腸桿菌中高效表達受許多因素影響,包括目標蛋白自身編碼基因、表達載體、表達宿主菌和誘導表達的條件等[25-27]。常用的原核表達載體有pET系列載體(His標簽)和pGEX系列載體(GST標簽)[28-30]。為了研究不同表達載體對OsAHP2蛋白表達的影響,本研究將OsAHP2基因分別連入pET-32a和pGEX-4T-1載體,分別轉化大腸桿菌表達菌株Rosseta和XA90,SDS-PAGE結果顯示,0.5 mmol/L IPTG誘導不同時間,pET-32a-OsAHP2中融合蛋白的表達量均高于pGEX-4T-1-OsAHP2。因此,選擇pET-32a-OsAHP2重組菌株進行后續試驗。可溶性分析顯示,OsAHP2融合蛋白在上清和包涵體中均有一定量的表達,因為包涵體中多肽鏈往往由于折疊錯誤而使蛋白失去活性,需要經過復雜的變性復性過程才能得到有活性的蛋白,所以本研究采取了從可溶性蛋白中純化OsAHP2融合蛋白的策略。

OsAHP2開放閱讀框全長450 bp,編碼149個氨基酸,為了設計引物的匹配性,本研究設計了OsAHP2基因上下游特異引物,PCR擴增獲得557 bp(包括開放閱讀框450 bp及終止密碼子下游的107 bp)的OsAHP2全長基因。本研究選取的原核表達載體pET-32a和pGEX-4T-1上的融合蛋白標簽均位于目的基因5′端,并且由于目的基因3′端包含了終止密碼子,因此,多擴增出的107 bp不會表達出蛋白,從而保證了融合蛋白的正確性。pET-32a-OsAHP2在Rosseta中誘導表達的融合蛋白約為35 ku,與理論值基本一致。

本研究構建了2個OsAHP2原核表達載體,通過His鎳離子親和層析柱從融合蛋白表達量較高的pET-32a-OsAHP2重組菌中純化到了大量純度較高的OsAHP2融合蛋白,為后續研究OsAHP2與細胞分裂素信號轉導通路中其他蛋白的相互作用和磷酸化分析奠定了基礎。