N-3-羰基十四烷酰基高絲氨酸內(nèi)酯誘導(dǎo)番茄對(duì)灰霉病抗性機(jī)制初探

楊向云,劉 方,趙 芊,宋水山,張利平

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071000；2.河北省科學(xué)院 生物研究所,河北 石家莊 050000；3.河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心,河北 石家莊 050081)

N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserine lactones, AHLs)是由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的,作為一種通訊信號(hào)分子參與細(xì)胞間信息交流,由其介導(dǎo)的細(xì)菌群體感應(yīng)(Quorum sensing, QS)參與細(xì)菌多種生物學(xué)功能的調(diào)控[1-2]。近年來(lái),越來(lái)越多的證據(jù)表明,AHLs不僅可以被細(xì)菌感知調(diào)控細(xì)菌的群體行為,而且會(huì)對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生影響[3-4]。AHLs被認(rèn)為是引發(fā)誘導(dǎo)物,使植物宿主具有更快和更強(qiáng)的抵抗力,抵抗環(huán)境的脅迫[5]。植物可以通過(guò)感受AHLs,進(jìn)而感知環(huán)境中細(xì)菌的存在,并做出主動(dòng)和適宜的響應(yīng),調(diào)控其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和抗病抗逆反應(yīng)[6-7]。

番茄(Solanumlycopersicum)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,其食用方法多種多樣而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常豐富。從20世紀(jì)初開(kāi)始,番茄在我國(guó)就成了一種重要的蔬菜品種被人們廣泛種植,是我國(guó)不可缺少的經(jīng)濟(jì)作物之一。灰霉病(Botrytiscinerea) 作為一種全球性分布廣、發(fā)病率高且減產(chǎn)嚴(yán)重的植物真菌病害,在我國(guó)的番茄生產(chǎn)中灰霉病的危害極為突出,它常通過(guò)侵染植物的衰老或受損組織,從而在番茄上引起病斑或果實(shí)變軟?；颐咕芡ㄟ^(guò)植物表面?zhèn)跐B透到植物的內(nèi)部組織,而且能從一開(kāi)始的壞死部位傳染至植物的健康部位[8]?；颐咕秩局参飼r(shí),植物能產(chǎn)生一系列的生理生化反應(yīng),比如植物系統(tǒng)內(nèi)部的超敏反應(yīng)、抗性相關(guān)路徑、抗性相關(guān)基因表達(dá)、植物蛋白酶系統(tǒng)、氣孔關(guān)閉等來(lái)抵御灰霉的侵染[9-16],而其中最主要的方式為茉莉酸(JA)信號(hào)路徑,JA可作為信號(hào)物質(zhì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性,甲基化的JA可運(yùn)輸?shù)街参镂幢磺秩镜牟糠植⑼ㄟ^(guò)COI1調(diào)控PI1、PI2等抗性相關(guān)基因的表達(dá)[17],但植物僅僅依靠自身的抗性不能完全有效的抵御病害的發(fā)生。番茄灰霉病可以侵染葉、莖、花、果實(shí)等各個(gè)部位,鄒慶道等[18]利用26份番茄材料,對(duì)番茄葉片、莖以及果實(shí)接種灰霉孢子后進(jìn)行部位抗病性相關(guān)性分析,結(jié)果表明,番茄抗灰霉病葉部、莖部和果實(shí)的相關(guān)性不明顯,需根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x取適當(dāng)部位進(jìn)行接種。葉片是最易操作也是最能直觀體現(xiàn)抗性的部位,故番茄對(duì)灰霉抗性試驗(yàn)大多利用番茄葉片進(jìn)行。到目前,生產(chǎn)上對(duì)此病害的控制仍是藥物控制,使病原菌產(chǎn)生抗藥性且對(duì)環(huán)境保護(hù)帶來(lái)巨大壓力。在此情況下,一種環(huán)境友好型且對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用的植物新型誘抗劑的發(fā)現(xiàn)及研究將有重大意義。

已有研究表明,植物根際環(huán)境中由有益的革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的脂類物質(zhì) AHLs 可以提高植物對(duì)真菌病害的抗病性。生物工程實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),短鏈的 AHLs 中的N-3-羰基己?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-3-oxo-hexanoyl-homoserinelactone,3OC6-HSL) 和N-3-羰基辛酰基高絲氨酸內(nèi)酯(N-3-oxo-octanoyl-homoserine lactone,3OC8-HSL)可以誘導(dǎo) G 蛋白信號(hào)系統(tǒng)的變化從而誘導(dǎo)植物根系的伸長(zhǎng)、促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育；另外 3OC8-HSL 可以激發(fā)植物的免疫狀態(tài)從而誘導(dǎo)植物對(duì)病原菌丁香假單胞PstDC3000 和胡 蘿 卜 軟 腐 果 膠 桿 菌(Pectobacteriumcarotovoram)的抗性。基于以上研究結(jié)果,推測(cè)植物能感應(yīng)不同長(zhǎng)度脂肪酸側(cè)鏈的AHLs,并且做出不同的響應(yīng)。AHLs ?；滈L(zhǎng)度的不同會(huì)影響其對(duì)植物天然免疫能力的調(diào)節(jié),長(zhǎng)鏈 AHLs 似乎更有利于增強(qiáng)植物的抗病性。因此,本試驗(yàn)以番茄為對(duì)象,以灰霉為指示菌,探索AHLs信號(hào)分子誘導(dǎo)植物抵抗真菌病害的效果及其抗性相關(guān)的信號(hào)通路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 供試番茄品種為雜交種1097,采購(gòu)自天津市宏程芹菜研究所,為普通番茄雜交種。室溫下浸泡番茄種子6 h后,置于28 ℃培養(yǎng)箱催芽3～4 d,將發(fā)芽的種子種在營(yíng)養(yǎng)土與蛭石比例為1∶2混合拌勻的基質(zhì)中,室溫下培養(yǎng),待番茄長(zhǎng)到5～6輪葉片時(shí),選取長(zhǎng)勢(shì)大小一致的葉片進(jìn)行試驗(yàn)。病原菌：供試灰霉菌由田間分離所得,分離得到的灰霉菌轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上,20 ℃培養(yǎng)箱放置。

1.1.2 試劑 試驗(yàn)用到的信號(hào)分子購(gòu)買自Sigma公司,用丙酮作溶劑溶解信號(hào)分子,試驗(yàn)用的終濃度為10 μmol/L。TaqTMDNA 聚合酶、Marker DL2000、SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司(大連)。過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自索萊寶生物公司(北京)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 灰霉孢子菌懸液的配制 田間分離得到的灰霉菌20 ℃培養(yǎng)10 d左右,用無(wú)菌水從PDA平板上洗脫孢子,紗布過(guò)濾菌絲,用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL。

1.2.2 AHLs誘導(dǎo)番茄對(duì)灰霉病抗性離體試驗(yàn) 當(dāng)番茄長(zhǎng)至5～6輪葉片時(shí),采集長(zhǎng)勢(shì)大小一致的番茄葉片,每組為3片平行葉片。在10 μmol/L濃度的信號(hào)分子N-癸?；呓z氨酸內(nèi)酯(C10-HSL)、N-十二?；呓z氨酸內(nèi)酯(C12-HSL)、N-十四?；呓z氨酸內(nèi)酯(C14-HSL)、N-3-羰基辛?；呓z氨酸內(nèi)酯(3OC8-HSL)、N-3-羰基十二酰基高絲氨酸內(nèi)酯(3OC12-HSL)和3OC14-HSL中浸泡48 h后接灰霉菌塊,放在20 ℃培養(yǎng)箱,5 d后觀察葉片發(fā)病情況。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 AHLs誘導(dǎo)番茄對(duì)灰霉病抗性活體試驗(yàn) 當(dāng)番茄長(zhǎng)到5～6輪葉片時(shí),分別用不同AHLs信號(hào)分子C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL、3OC8-HSL、3OC12-HSL 和3OC14-HSL(10 μmol/L)均勻噴濕整株植物的所有葉片表面,直到滴水為止,預(yù)處理48 h后再用灰霉孢子菌懸液(2×105個(gè)/mL)均勻噴濕植株所有葉片,溫濕度為25 ℃/80%,丙酮作對(duì)照,接菌5 d后觀察葉片發(fā)病情況,統(tǒng)計(jì)番茄葉片發(fā)病病情指數(shù)。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù),每次同一處理設(shè)定2盆植株。

1.2.4 病情指數(shù)的計(jì)算 參照田龍等[19]的方法,番茄灰霉病發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí) 無(wú)病斑；1 級(jí) 病斑面積占整個(gè)葉面積的 5%以下；3 級(jí) 病斑面積占整個(gè)葉面積的 6%～15%；5 級(jí) 病斑面積占整個(gè)葉面積的 16%～25%；7 級(jí) 病斑面積占整個(gè)葉面積的 26%～50%；9 級(jí) 病斑面積占整個(gè)葉面積的 50%及以上。采用分級(jí)計(jì)數(shù)法計(jì)算病情指數(shù)。

病情指數(shù)=∑(各級(jí)株數(shù)×各級(jí)級(jí)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值)×100%。

在病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)時(shí),包括每次同一處理2盆植株的所有葉片。

1.2.5 總RNA的提取、純化、cDNA的合成 分別在信號(hào)分子3OC14-HSL處理番茄葉片接種灰霉孢子菌懸液的0,1,2,4 d取樣,提取植物組織的RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定抗病相關(guān)基因的表達(dá)量。TRIzol法提取總RNA, 提取的RNA進(jìn)行純化以及反轉(zhuǎn)錄。

基因組去除反應(yīng)體系：2.0 μL 5×gDNA Eraser Buffer,1.0 μL gDNA Eraser,1.0 μg Total RNA,6.0 μL RNase Free ddH2O；反應(yīng)條件:42 ℃,2 min。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：10.0 μL 步驟1的反應(yīng)液,1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix 1,1.0 μL RT Primer Mix,4.0 μL 5×PrimeScript Buffer 2,4.0 μL RNase Free ddH2O,37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 模板,根據(jù)其濃度進(jìn)行 10～15 倍的稀釋。10 μL SYBR Premix Ex Taq,0.8 μL PCR 正向引物,0.8 μL PCR 反向引物,0.4 μL ROX Reference DyeⅡ,5 μL cDNA模板,3 μL ddH2O；反應(yīng)體系：95 ℃ 10 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 31 s,95 ℃ 15 s,40個(gè)循環(huán) 。引物如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物Tab.1 Primers used for Real-time PCR

1.2.7 番茄DAB染色 參考Thordal-Christensen 等[20]的方法來(lái)檢測(cè)番茄葉片中H2O2積累情況。在有過(guò)氧化物酶存在時(shí),DAB與H2O2反應(yīng),會(huì)迅速變成紅褐色。蛋白質(zhì)定量后,結(jié)合過(guò)敏性反應(yīng),選擇一最適濃度,均勻地輕輕地噴灑于植物葉片表面；剪取葉柄基部,輕輕地浸入DAB染色液(2.5 g/mL)中,避免碰傷葉片的其他部位,于28 ℃下,光照染色8～12 h；將DAB染色液倒干凈,加入95%乙醇脫色,直至組織透明；組織透明后,整體拍照；水懸浮葉片,局部鏡檢,觀察死亡細(xì)胞。取樣3片作為平行處理,試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 過(guò)氧化氫(H2O2)含量的測(cè)定 過(guò)氧化氫含量的測(cè)定用Solarbio試劑盒測(cè)定。取樣3片作為平行處理,試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 抗病相關(guān)酶活性 過(guò)氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)酶活用Solarbio試劑盒測(cè)定。取樣3片作為平行處理,試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同信號(hào)分子預(yù)處理番茄后對(duì)灰霉病抗性效果分析

如圖1所示,在AHLs誘導(dǎo)番茄對(duì)灰霉病抗性離體試驗(yàn)中,番茄離體葉片在接灰霉菌塊5 d后,番茄葉片出現(xiàn)了不同程度的壞死,葉片枯萎、變黃,與菌塊交接處有菌絲長(zhǎng)出。不同信號(hào)分子預(yù)處理后的葉片相對(duì)于溶劑處理對(duì)照表現(xiàn)出了不同的抗性效果,其中用C10-HSL、3OC8-HSL、C12-HSL和C14-HSL預(yù)處理后,葉片壞死程度高,與對(duì)照葉片發(fā)病情況類似,沒(méi)有明顯的抗病效果；而用3OC12-HSL和3OC14-HSL預(yù)處理后,與對(duì)照組相比,壞死葉片減少,發(fā)黃腐爛程度減輕,未看見(jiàn)明顯的菌絲繁殖,表現(xiàn)出了明顯且穩(wěn)定的抗性效果。

丙酮對(duì)照.丙酮預(yù)處理葉片后接菌；C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL、3OC8-HSL、3OC12-HSL、3OC14-HSL.相應(yīng)的信號(hào)分子預(yù)處理后接菌；空白對(duì)照.不進(jìn)行任何處理,不接菌。

在盆栽番茄中,用灰霉孢子懸液噴灑番茄葉片5 d后,不同信號(hào)分子處理后的葉片表現(xiàn)出了不同的抗性效果。按照葉片發(fā)病程度的輕重劃分了0～9級(jí),按照?qǐng)D2-A的發(fā)病等級(jí)圖來(lái)統(tǒng)計(jì)番茄發(fā)病的病情指數(shù)。

從圖2-B可以看出,番茄葉片在接種灰霉孢子5 d后,用信號(hào)分子3OC12-HSL和3OC14-HSL處理的盆栽番茄植株,葉片發(fā)病程度與其他處理組差異顯著,病情指數(shù)顯著低于其他處理組,這表明了3OC12-HSL和3OC14-HSL的處理對(duì)番茄灰霉菌有顯著的抗性效果,但二者差異不顯著。結(jié)合圖1試驗(yàn)結(jié)果,信號(hào)分子3OC12-HSL 和3OC14-HSL無(wú)論是番茄葉片對(duì)灰霉抗性的離體試驗(yàn)還是盆栽試驗(yàn),都表現(xiàn)出了顯著且穩(wěn)定的抗性,二者差異雖不顯著,但后者處理組病情指數(shù)更低。因此,選用信號(hào)分子3OC14-HSL來(lái)進(jìn)行后續(xù)的研究。

A.0～9級(jí)發(fā)病等級(jí)圖；B.盆栽番茄植株的病情指數(shù)。不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖3-5同。

2.2 信號(hào)分子誘導(dǎo)番茄對(duì)灰霉產(chǎn)生抗性依賴于JA信號(hào)途徑

茉莉酸信號(hào)通路在植物對(duì)灰霉病的抗病信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用,因此,選用抗性效果最佳的3OC14-HSL預(yù)處理盆栽番茄,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,檢測(cè)抗病相關(guān)基因的表達(dá)變化。從圖3可以看出,與空白對(duì)照組相比,番茄葉片在接種灰霉孢子1 d后基因NPR1顯著上調(diào),PR1、PI2和PI1變化不顯著；用3OC14-HSL處理番茄葉片再接灰霉之后,JA信號(hào)路徑關(guān)鍵基因PI2和PI1較空白對(duì)照、丙酮對(duì)照及3OC14-HSL對(duì)照均顯著上調(diào),而與SA信號(hào)路徑相關(guān)的基因NPR1基因較空白對(duì)照顯著下調(diào),PR1基因較空白對(duì)照變化不顯著,但較丙酮對(duì)照則顯著下調(diào)。

選用3OC14-HSL處理番茄再接種灰霉,JA信號(hào)通路關(guān)鍵基因PI1、PI2顯著上調(diào),說(shuō)明JA信號(hào)通路參與了番茄和灰霉的互作,3OC14-HSL有可能通過(guò)刺激JA信號(hào)路徑來(lái)提高番茄對(duì)真菌性病害灰霉的抗性。

CK.不作任何處理，不接菌;3OC14-HSL.3OC14-HSL預(yù)處理，不接菌；B.cinerea.丙酮預(yù)處理，接灰霉菌；3OC14-HSL+B.cinerea.3OC14-HSL預(yù)處理，接灰霉菌。圖4-5同。CK.No treatment, no inoculation; 3OC14-HSL.3OC14-HSL pretreatment, no inoculation; B. cinerea.Acetone pretreatment, inoculation; 3OC14-HSL+B.cinerea.3OC14-HSL pretreatment, inoculation.The same as Fig.4-5.

2.3 信號(hào)分子處理對(duì)活性氧積累的影響

近年來(lái)的研究表明,植物和病原菌的相互識(shí)別會(huì)誘導(dǎo)活性氧(ROS)的產(chǎn)生?；钚匝踝鳛樾碌男盘?hào)傳遞激活防衛(wèi)反應(yīng), 氧爆發(fā)被認(rèn)為是抗病過(guò)程反應(yīng)的特征性反應(yīng),也是植物對(duì)病原物應(yīng)答的最早期的反應(yīng)之一[21-22],在植物的抗病性中具有很重要的作用。

在信號(hào)分子3OC14-HSL預(yù)處理番茄葉片48 h再接種灰霉0,2,4 d后,對(duì)其進(jìn)行了DAB染色及H2O2含量的測(cè)定,觀察番茄葉片在接種真菌灰霉孢子菌懸液之后活性氧積累的情況。

從圖4-A中可以看出,隨著接種灰霉孢子時(shí)間的增加,葉片活性氧積累能力也在增強(qiáng)。丙酮對(duì)照組和測(cè)定組與空白對(duì)照相比,通過(guò)DAB染色檢測(cè)到有大量的深棕色物質(zhì)在植物葉肉組織積累,而空白對(duì)照沒(méi)有此現(xiàn)象。而且,用信號(hào)分子3OC14-HSL處理過(guò)的葉片比對(duì)照組有更多的棕色物質(zhì)積累。

A.番茄葉片DAB染色后在顯微鏡下觀察拍攝的圖片，比例為1∶200PX。A.The picture taken under the microscope after DAB staining of tomato leaves, the ratio is 1∶200PX.

從圖4-B中可以看出,H2O2含量的變化趨勢(shì)與DAB染色結(jié)果一致。隨著接種灰霉孢子時(shí)間的增加,葉片中活性氧含量也在增加,丙酮對(duì)照組和測(cè)定組與空白對(duì)照相比,H2O2含量在2 d后有了較大幅度的增加,接菌4 d后測(cè)定組H2O2含量可以達(dá)到對(duì)照組的2～3倍,而空白對(duì)照含量沒(méi)有顯著變化。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明,信號(hào)分子3OC14-HSL的處理加速了植物活性氧爆發(fā),加速了對(duì)病原菌的抗性應(yīng)激,這可能對(duì)下游抗病信號(hào)的傳遞及植物抗病起到了積極的效果。

2.4 信號(hào)分子處理對(duì)番茄抗病相關(guān)酶活性的影響

植物在逆境下會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)活性氧的爆發(fā), 激發(fā)植物的抗病反應(yīng)[23], 但是活性氧的積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)受損傷, 引起植物體內(nèi)發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng), 造成植物組織受損害。植物的保護(hù)反應(yīng)是植物體內(nèi)新陳代謝的結(jié)果, 其生理反應(yīng)是通過(guò)抗性相關(guān)酶催化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。SOD和POD是植物體內(nèi)重要的防御酶, 能清除活性氧,抵御活性氧及氧自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷, 還能增強(qiáng)植物對(duì)病害的抵抗力。SOD和POD活性高低能反映出植物體內(nèi)抗氧化能力的強(qiáng)弱, 常作為檢測(cè)植物抗逆性的指標(biāo)。

如圖5所示,番茄葉片內(nèi)的POD和SOD活性在灰霉菌侵染過(guò)程中趨勢(shì)相似,都是先升高后逐漸降低,其中空白對(duì)照和3OC14-HSL對(duì)照組的POD和SOD活性隨著時(shí)間增加都沒(méi)有顯著的變化,丙酮對(duì)照和3OC14-HSL處理組都是在接菌2 d后達(dá)到峰值,POD和SOD的活性最高,與對(duì)照組相比有了顯著的提高,且在接菌2 d時(shí)這2個(gè)處理差異顯著；信號(hào)分子3OC14-HSL接灰霉菌處理的POD和SOD活性一直高于丙酮對(duì)照、空白對(duì)照和3OC14-HSL對(duì)照。這些結(jié)果說(shuō)明信號(hào)分子3OC14-HSL的處理可使番茄在接菌后保持較高的POD和SOD活性。

圖5 3OC14-HSL處理對(duì)酶活性的影響Fig.5 Effect of 3OC14-HSL treatment on enzyme activity

3 討論與結(jié)論

在植物根際存在著很多產(chǎn)AHLs的革蘭氏陰性菌,它們通過(guò)合成并釋放AHLs作為信號(hào)分子來(lái)協(xié)調(diào)群體行為。AHLs具有一個(gè)保守的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)和一個(gè)長(zhǎng)度在4～18個(gè)碳原子的?；鶄?cè)鏈。側(cè)鏈含4～8個(gè)碳原子的是短鏈AHLs,含10～18個(gè)碳原子的是長(zhǎng)鏈AHLs。AHLs由其酰基側(cè)鏈的長(zhǎng)度(4～18個(gè)碳原子)、?；鶄?cè)鏈的飽和水平及C3位取代基(羰基或羥基)的不同而有不同的功能[24]。

據(jù)報(bào)道,細(xì)菌產(chǎn)生的AHLs在植物系統(tǒng)抗性誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。當(dāng)植物遭受病原體感染時(shí),3OC14-HSL可以誘導(dǎo)擬南芥和大麥植物對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型和半活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌的抗性[25]。在番茄根際施加產(chǎn)N-丁?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-butyl-homoserine lactone,C4-HSL)和N-己?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-hexanoyl-homoserine lactone,C6-HSL)的沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)MG1可提高番茄對(duì)病原真菌鏈格孢霉(Alternariaalternata)的系統(tǒng)抗性,而突變株(失去合成AHLs能力)的MG44誘導(dǎo)番茄抗病性的能力明顯降低[26]。expR編碼草木樨中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)中AHL受體蛋白。過(guò)表達(dá)expR的菌株S.melilotiexpR+可以產(chǎn)生比其親本菌S.melilotiRm 2011更多的3OC14-HSL。用S.melilotiexpR+接種擬南芥可以誘導(dǎo)對(duì)丁香假單胞菌(PseudomonessyringaeDC3000)產(chǎn)生抗性。同樣,用S.melilotiexpR+處理大麥、小麥和番茄也能誘導(dǎo)對(duì)小麥白粉病(Blumeriagraminis)、稈銹病(Pucciniagraminis)和疫霉(Phytophthorainfestans)的抗性[27]。還有研究發(fā)現(xiàn)，C10-HSL在對(duì)真菌灰霉(B.cinerea)的系統(tǒng)抗性中有積極作用,而且不同的植物受體感知不同的AHLs會(huì)觸發(fā)不同的植物免疫信號(hào)通路[28]。最新數(shù)據(jù)表明,3OC8-HSL可以引發(fā)擬南芥細(xì)菌感染后的防御反應(yīng),而且3OC8-HSL引發(fā)的抗病性取決于水楊酸信號(hào)通路[29]。在本研究中,通過(guò)設(shè)置不同酰基側(cè)鏈長(zhǎng)度和不同修飾的信號(hào)分子預(yù)處理番茄植物葉片,然后接種灰霉,觀察在信號(hào)分子預(yù)處理下,植物葉片的發(fā)病情況。通過(guò)觀察番茄葉片離體表型試驗(yàn)以及統(tǒng)計(jì)盆栽試驗(yàn)病情指數(shù),發(fā)現(xiàn)不同酰基側(cè)鏈長(zhǎng)度和修飾不同的信號(hào)分子對(duì)灰霉病抗性效果差異顯著。從抗病表型試驗(yàn)結(jié)果可以看出，用信號(hào)分子3OC12-HSL和3OC14-HSL預(yù)處理番茄葉片后,與對(duì)照組相比,發(fā)黃腐爛程度明顯減輕,未看見(jiàn)明顯的菌絲繁殖,表現(xiàn)出了明顯且穩(wěn)定的抗性效果,但是這2個(gè)信號(hào)分子效果差異不顯著,相較而言,3OC14-HSL處理組病情指數(shù)低于3OC12-HSL處理組,所以選擇了3OC14-HSL進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)探索,而且推測(cè)植物能感應(yīng)不同長(zhǎng)度脂肪酸側(cè)鏈的AHLs,并做出不同的響應(yīng),長(zhǎng)鏈的AHLs似乎更有利于增強(qiáng)植物的抗病性。

茉莉酸是一種公認(rèn)的植物激素,參與植物對(duì)病原體的防御機(jī)制,植物在感染病原菌后,JA的含量會(huì)顯著增加[30-33]。在擬南芥上,JA生物合成突變體aos或者JA 轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體coi1和pad3大幅度降低了植物對(duì)灰霉的抗性[34-35]。用C10-HSL處理番茄后可以提高植物對(duì)灰霉的抗性,提高了植物的防御能力,而且這主要是取決于植物JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[27]。PI類基因是用于增強(qiáng)植物對(duì)昆蟲和病原微生物的防御能力的JA信號(hào)標(biāo)記基因[36]。通過(guò)熒光定量PCR分析番茄抗病相關(guān)基因的表達(dá),研究在信號(hào)分子處理下番茄抵抗灰霉的分子作用機(jī)制。從qRT-PCR結(jié)果可以看出,3O14-HSL預(yù)處理番茄再接種灰霉可以顯著上調(diào)茉莉酸信號(hào)通路中的抗病關(guān)鍵基因PI1、PI2的表達(dá),而響應(yīng)水楊酸的基因PR1的表達(dá)較對(duì)照變化不顯著,而NPR1則顯著下調(diào),這些結(jié)果表明,JA信號(hào)通路參與了番茄和灰霉的互作,3OC14-HSL有可能通過(guò)刺激JA信號(hào)路徑來(lái)提高番茄對(duì)真菌病害灰霉的抗性。

有研究表明,接種S.melilotiexpR+激發(fā)的植物抗病性依賴于植物體內(nèi)活性氧的過(guò)量產(chǎn)生[27]。AHLs預(yù)處理的大麥接種白粉病后活性氧爆發(fā),導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)(Hypersensitive response,HR)水平提高,囊泡形成增多,過(guò)氧化物酶HVPRX7基因轉(zhuǎn)錄水平提高[37]。本試驗(yàn)中用信號(hào)分子3OC14-HSL處理番茄再接種灰霉后發(fā)現(xiàn),3OC14-HSL不僅促進(jìn)了茉莉酸誘導(dǎo)的活性氧爆發(fā),同時(shí)也使番茄葉片接菌后保持較高的POD、SOD活水平,這對(duì)植物抗病起到了積極的作用。

綜上所述,信號(hào)分子3OC14-HSL可以誘導(dǎo)番茄對(duì)真菌灰霉的抗性,使得番茄可以抵御灰霉的傷害,而且能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量的活性氧,使得植物體內(nèi)保持較高的POD、SOD活性,而且該抗性效果可能與茉莉酸信號(hào)路徑相關(guān)。本研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)3OC14-HSL作為植物免疫誘抗劑防治農(nóng)作物重要真菌病害奠定了理論基礎(chǔ)。