小麥miR395a前體克隆、遺傳轉化及組織表達模式分析

丁超杰 ，關園園 ，李成偉

(1.河南省糧食作物基因組編輯工程技術研究中心，河南 新鄉 453003；2.河南科技學院 生命科技學院，河南 新鄉 453003)

小麥是世界上重要的糧食作物之一，然而在其生長過程中容易受到真菌、細菌和病毒等多種病原菌的感染，對小麥產量和質量造成嚴重影響，如較嚴重的有白粉病、赤霉病等。小麥白粉病是由禾本科布氏白粉菌小麥專化型(Blumeriagraminisf.sp.tritici(Bgt))引起的世界性真菌病害，在亞洲、非洲和歐美等主產麥區都有發生，中國的小麥產區也幾乎都有發生，并有日趨嚴重之勢[1]。小麥赤霉病是由鐮刀菌(Fusariumgraminearum)引起的一種世界性病害，近年來，隨著全球氣候變暖以及耕作制度的變化，小麥赤霉病的發生頻率不斷增加，發生范圍也不斷擴大。這些病害的發生都嚴重影響了小麥的產量和質量[2]，因此，解決這些病害問題對小麥生產具有重要意義。由于小麥抗性品種比較少，目前，控制小麥病原菌發生的途徑主要是使用殺菌劑，而殺菌劑的大量噴施會造成農藥殘留和環境污染，因此，培育小麥抗病品種成為解決小麥病害的理想途徑。而不管是野生型還是人工選育的小麥抗病品種都比較匱乏，因此，快速、高效培育抗病品種迫在眉睫。傳統雜交育種時間長、效率低，而利用現代分子生物學手段，將抗病基因轉入栽培品種中使其獲得抗病性，是快速、有效獲得抗病品種的重要途徑，其中分子育種的關鍵是挖掘更多具有優良抗性的基因[3-4]。

前人的研究中已克隆了一些小麥抗病相關基因[5-6]，但抗性基因資源仍非常有限，而且抗病基因抗性單一，有效抗原沒有充分利用，加之新的病原菌小種產生速度非常快，許多抗性基因喪失抗性。因此，需要進一步尋找新的抗病基因資源。microRNA(miRNA)是一類生物體內普遍存在的長度為21～25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，主要通過與目標基因互補配對從而在轉錄后水平調控基因的表達，導致mRNA降解或抑制翻譯而參與植物體內多種生物學反應，在整個調控網絡中起到關鍵作用[7-8]。目前，已在許多植物中發現了miRNA的存在，對其功能的研究也越來越廣泛和深入。越來越多的研究表明，miRNA在植物抗病中也起著重要作用[9-11]，其參與的抗病反應主要是通過直接或間接調控抗病相關基因的表達量來實現的。miRNA482/2118超家族中的miRNA能夠調控NBS-LRR家族基因(抗病蛋白基因)的沉默，當番茄受到病原菌感染后，NBS-LRR家族基因的表達量迅速下降，植物抗病性發生變化[12]。此外，多主棒孢霉能夠引起黃瓜棒孢葉斑病，通過RNA-seq分析，當多主棒孢霉侵染黃瓜時，miR164d、miR396b、Novel-miR1和Novel-miR7表達量發生變化，當過量或抑制表達它們的靶基因時，黃瓜對多主棒孢霉的抗性會發生變化，因此，推測miRNA在黃瓜對多主棒孢霉抗性中起重要作用[13]。研究還發現，棉花中的miRNA168在棉花抗曲葉病毒中起著重要作用，其主要通過在轉錄水平或直接降解病毒中關鍵基因的表達量來影響病毒的復制，從而使棉花具有抗病毒性[14]。綜上表明，miRNA已成為植物與病原菌互作研究中的重要領域，通過抑制或誘導某種miRNA的產生，可以改變植物的抗病性，并且也從另一個角度應用于植物的抗病研究和育種中。

研究發現，miR395家族成員在受到病原菌侵入的應答反應中起著重要作用[15]。蘋果中miR395的靶基因為MdWRKY26，當過量表達miR395時，MdWRKY26表達量下降，而WRKY可以和病程相關蛋白(PR)互作，因此抑制表達miR395時，PR基因表達量升高，蘋果的葉斑病抗性增強[16]。棉花中的miR395a和miR395b參與調控棉花與曲葉病毒的互作[15]。通過生物信息學分析發現，miR395a成熟序列在各物種間具有較高的相似性。因此，推測miR395在植物抗病性方面具有一定的保守性。而目前關于其在小麥抗病方面的研究尚未見報道，為此，克隆小麥miR395a的前體序列，構建其過量表達載體并遺傳轉化小麥，同時分析其組織表達模式，以期為后續研究和解析miR395a在小麥抗病中的功能和作用機制提供材料來源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 供試材料為小麥栽培品種百農207。

1.1.2 質粒及菌種 大腸桿菌菌種DH5α、農桿菌菌種GV3101、克隆載體質粒pMD19-T、表達載體質粒pCambia1301。

1.1.3 酶和化學試劑 FastPfu酶購自全式金公司；限制性內切酶XbaⅠ和BamHⅠ、Marker DL 2000和T4DNA連接酶、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)和Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit均購自TaKaRa公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒購自天根生物公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥基因組DNA的提取 采用CTAB法[17]從小麥葉片中提取基因組DNA。

1.2.2 小麥miR395a前體基因的克隆 在NCBI上查找小麥miR395a的前體序列，設計引物，并在上、下游引物上分別加上BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點，引物序列如下：上游引物TmiR395-F為5′-GGATCCCTAGAGTTCCCTTGACCGCT-3′，下游引物TmiR395-R為5′-TCTAGAACGATATGTTAACATCGAAT-3′。30 μL PCR反應體系：5×Pfu Buffer 6 μL，FastPfu酶0.6 μL，上、下游引物各1.5 μL，dNTP 3 μL，小麥基因組DNA模板2 μL，ddH2O 15.4 μL。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33個循環；72 ℃ 10 min。

1.2.3 PCR產物的回收與測序 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收，連接至克隆載體pMD19-T上，轉化DH5α感受態細胞，挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，之后送至武漢金開瑞公司測序，將測序正確的質粒命名為pMD19-T-miR395a。

1.2.4 小麥miR395a前體的過量表達載體構建 用限制性內切酶BamHⅠ和XbaⅠ對載體pCambia1301和pMD19-T-miR395a分別進行雙酶切，完全酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳，用PCR產物回收試劑盒(天根瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒)進行純化回收后連接，10 μL連接體系如下：miR395a前體序列片段6 μL，線性化質粒1 μL，10×Buffer 1 μL，T4DNA連接酶0.2 μL，ddH2O 1.8 μL。16 ℃連接12 h后，轉化DH5α感受態細胞，通過菌落PCR和酶切鑒定，篩選出陽性轉化子，即過量表達載體，將其命名為pCambia1301-miR395a。

1.2.5 過量表達載體轉化農桿菌 將3 μL pCambia1301-miR395a質粒和100 μL農桿菌GV3101感受態細胞混勻，在冰上靜置30 min，之后液氮中放置5 min，取出后立即放入37 ℃培養箱5 min，隨后加入YEB(不含抗生素)800 μL，在28 ℃恒溫搖床中復蘇3～5 h，用涂布棒均勻涂在YEB固體培養基(含Rif和Kan抗生素)上。將平板放在28 ℃培養箱中培養2～3 d，通過菌落PCR鑒定，篩選出陽性菌落，備用。

1.2.6 農桿菌介導的小麥遺傳轉化 小麥的遺傳轉化方法，參照Supartana等[18]的報道。

1.2.7 轉基因小麥的PCR檢測 采用CTAB法提取轉基因當代小麥葉片的基因組DNA，使用嵌合引物，即在過量表達載體中啟動子序列上設計上游引物S1：5′-CTCCTACAAATGCCATCATT-3′，miR395a前體序列上設計下游引物S2：5′-AGAACTTCACAGTGGTCTTA-3′，進行PCR，擴增片段長度約為580 bp，PCR陽性對照模板為質粒pCambia1301-miR395a，陰性對照為水對照和未轉基因植株。

1.2.8 組織表達部位分析 總RNA的提取采用TRIzol法，反轉錄使用TaKaRa的miRNA反轉錄試劑盒Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit，按照操作說明進行。將反轉錄產物稀釋100倍作為模板，進行熒光定量分析，熒光定量試劑盒使用TaKaRa的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)，按照操作說明進行。每個組織部位3個重復；上游引物為miR395a的特異引物：5′-GTGAAGTGTTTGGGGGAACTC-3′，下游引物為前體序列引物S2：5′-AGAACTTCACAGTGGTCTTA-3′；內參基因為GAPDH。熒光定量的結果采用2-ΔΔCT方法計算。

2 結果與分析

2.1 miR395a成熟序列比對分析

從miRBase(http：//www.mirbase.org)中分別獲得不同物種的miR395a成熟序列，分析發現，miR395a在不同物種中具有較高的保守性，其中小麥與擬南芥、番茄以及大豆中的miR395a成熟序列具有高度一致性(圖1)，推測其功能上也具有保守性。

圖1 miR395a成熟序列比對分析Fig.1 Alignment analysis of mature miR395a sequence

2.2 小麥miR395a前體序列的克隆

根據在miRBase和NCBI上獲得的miR395a的前體序列，設計引物，擬擴增出384 bp的片段。以小麥葉片的基因組DNA為模板，以TmiR395-F和TmiR395-R為引物，進行PCR擴增，擴增結果如圖2所示。對該條帶進行回收、連接至克隆載體pMD-19T上，并進行測序。對測序結果在DNAMAN上進行比對分析，發現所獲片段與NCBI中獲得的miR395a前體序列的堿基完全一致，表明已成功克隆該序列。

M.DNA標準；1，2.miR395a擴增結果。M.Marker；1，2.Products of pre-miR395a.

2.3 小麥miR395a前體過量表達載體的構建

將以上測序正確的pMD-19T-miR395a重組質粒和表達載體pCambia1301質粒同時用BamHⅠ和XbaⅠ進行雙酶切，將目的基因片段和線性化的pCambia1301切膠回收、連接，菌落PCR初步鑒定陽性轉化子pCambia1301-miR395a，進一步通過酶切鑒定，能夠切割出預期連入的miR395a前體片段396 bp(圖3)，證明過量表達載體構建成功。

M.DNA標準；1，2.重組載體酶切鑒定結果。 M.Marker；1，2.Products of pCambia1301-miR395a digested by restriction enzyme.

2.4 農桿菌介導法遺傳轉化小麥

采用農桿菌介導的方法，將miR395a前體過量表達載體遺傳轉化小麥，獲得56株T0轉基因植株(圖4)，并已收獲種子。

圖4 小麥轉基因T0植株表型Fig.4 Phenotype of T0 transgenic wheat

2.5 轉基因小麥植株的PCR檢測

提取56株小麥T0植株的基因組DNA，同時以構建好的過量表達質粒作陽性對照，水和未轉基因植株作陰性對照，進行PCR擴增。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，在56株轉基因植株中，11株轉基因植株擴增出和陽性質粒大小一致的約580 bp片段，且與預期大小一致，而其余45株轉基因植株、水對照和未轉基因植株均未擴增出目標條帶(圖5)。同時也進行了GUS染色，與PCR結果一致，說明miR395a前體已成功轉入小麥中，陽性率約20%。

M.DNA標準；P.過量表達載體質粒對照；WT.未轉基因植株；ddH2O.水對照；1-11.T0轉基因植株。M.Marker；P.Plasmid；WT.Wild type；ddH2O.Double distilled water；1-11.11 lines of T0 transgenic plants.

2.6 小麥miR395a的組織表達模式分析

利用RT-qPCR技術，分析miR395a在小麥不同組織部位中的表達量(圖6)，結果顯示，miR395a為組成型表達，但在不同組織中的表達量有差異，其中在三葉期和抽穗期葉片中的表達量較高，葉鞘中次之，旗葉中表達量最低。

圖6 小麥miR395a的組織表達模式分析Fig.6 Analysis of tissue expression pattern of miB395a in wheat

3 結論與討論

病害嚴重影響了小麥的產量和質量，小麥與病原菌互作是目前小麥研究中的熱點領域。miRNA在植物抗病中的功能越來越多地被報道，如當番茄受到致病疫霉菌的感染時，其中的一些miRNA表達量發生明顯變化，分析它們的靶基因均為一些植物病程相關蛋白，說明miRNA參與番茄對致病疫霉菌的防御反應[19]。前期的試驗結果表明，小麥中一些miRNA的表達量也能夠響應白粉菌的誘導，其中包括miR395a。而有關miR395家族成員的功能，早期的研究主要集中在其對硫酸鹽吸收中的作用[20-21]，發現其能夠調控擬南芥對SO2的抗性，也即其能參與非生物脅迫的應答反應。最近相關的研究表明，miR395也參與植物抗病反應[14]。

序列分析發現，miR395a的成熟序列在不同物種中具有較高的保守性，推測其功能也具有保守性。而miR395a在小麥抗病中的功能還未見報道。為了進一步研究其功能，本試驗克隆了小麥miR395a前體序列，并將其過量表達載體遺傳轉化至小麥中，在基因組水平設計嵌合引物，通過PCR擴增鑒定出陽性植株，同時通過GUS染色，進一步確定陽性植株。目前這些植株已經成熟并收獲種子。同時本研究還對miR395a的組織表達模式進行了分析，結果顯示，其為組成型表達，其中在三葉期和抽穗期的葉中表達量最高，表明其在小麥生長各個階段都可能發揮作用，但主要在葉片中起作用。下一步將篩選陽性T0植株的種子，并對T1葉片接種白粉菌等病原菌，進行小麥抗性鑒定試驗，研究miR395a是否具有對白粉病等的抗性反應，并在穗期對轉基因小麥進行赤霉病抗性鑒定，進一步深入研究miR395a在小麥廣譜抗病中的功能及作用機制。