花粉管通道和農(nóng)桿菌介導的花生AhFatB基因編輯

潘雷雷,紀紅昌,黃建斌,淮東欣,雷 永,隋炯明,唐艷艷,朱 虹,姜德鋒,王晶珊,喬利仙

(1.農(nóng)業(yè)部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室,湖北 武漢 430062;2.青島農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山東省花生產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 青島 266109)

隨著分子生物學及基因工程技術的飛速發(fā)展,轉基因技術成為研究基因功能和植物改良的重要途徑,高效遺傳轉化體系的建立便成為影響物種間功能基因發(fā)掘及研究利用的限制條件。目前，在植物遺傳轉化中普遍應用的轉化方法主要有農(nóng)桿菌介導法和DNA直接導入法。農(nóng)桿菌介導法具有操作簡單、成本低、轉化頻率高等優(yōu)點,但需依賴于物種高效的再生體系,存在再生周期長等缺點[1-2]。DNA 直接導入法主要包括基因槍轟擊法以及花粉管通道法。其中基因槍轟擊法受體類型廣泛,無物種限制,但存在轉化頻率低、價格昂貴以及后代遺傳不穩(wěn)定等缺點[1-2]。花粉管通道法是由我國科學家周光宇[3]于1979年首先提出和設計的,與其他方法相比,該法操作簡便,無需昂貴的儀器和化學藥品,注射后直接收獲種子，無須經(jīng)過組織培養(yǎng)再生,且轉化周期短,其首先在棉花上獲得成功應用[4]。

花生屬于比較難于轉化的作物,目前花生遺傳轉化的方法主要有農(nóng)桿菌介導法和花粉管通道法,使用的外植體有胚小葉、子葉節(jié)、胚軸、幼葉等[5-8]。王鳳歡等[9]對農(nóng)桿菌介導的花生胚小葉遺傳轉化體系進行優(yōu)化,使抗性叢生芽誘導率可達到15%～93%。賈宇臣等[10]以子葉節(jié)為外植體進行研究,獲得最佳轉化條件。邱金梅等[11]利用農(nóng)桿菌EHA105菌株侵染花生胚軸外植體,認為外植體在真空中侵染利于轉化。鐘育海等[12]研究認為在農(nóng)桿菌菌液中添加煙草提取物,以及超聲波處理,可使子葉外植體的分化率達到86%。花粉管通道法最初用于外源DNA的轉移,如申馥玉等[13]和梁炫強等[14]提取高抗銹病的花生野生種Arachisglabrata基因組DNA,通過花粉管通道法導入栽培品種白沙1016中,結果獲得抗銹病性及其他性狀明顯轉移的株系。王亞等[15]、范乾程等[16]通過花粉管通道法將攜帶外源基因的重組農(nóng)桿菌導入花生,PCR檢測陽性率分別為34.7%和18.0%。

CRISPR-Cas9 技術是最新發(fā)展的基因編輯技術,可以對特定DNA 進行定點切割,并進一步引起靶基因的定點突變。運用 CRISPR/Cas9 技術已經(jīng)在水稻、小麥、玉米三大作物上實現(xiàn)了高效精確的單堿基定點突變[17],并顯著提高了水稻白葉枯病抗性[18]。但基因編輯同樣要依賴于成熟高效的遺傳轉化體系,由于基因編輯是在外源質粒成功轉化的基礎上發(fā)生,所依賴的遺傳轉化體系需要具有更高的轉化效率,方可提高編輯的效率。因此,簡單高效遺傳轉化體系的建立也成為基因編輯有效利用的途徑。

花生是重要的油料作物,花生油富含多種脂肪酸,主要包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸,分別占到總脂肪酸含量的20%和80%。由于飽和脂肪酸被認為對人體有害,故降低飽和脂肪酸含量成為花生育種的目標之一。高等植物中的FatB(acyl-ACP thioesterase, 酰基-ACP 硫脂酶)主要編碼生成飽和脂酰碳鏈的硫酯酶,催化飽和脂肪酸的合成釋放。采用RNA干涉技術沉默F(xiàn)atB基因的表達使棉籽油中的C16∶0含量從最初的20%下降到8%；過表達C12∶0-ACP硫酯酶的轉基因擬南芥和油菜中月桂酸含量顯著增加[19]。在亞麻薺中將FAD2基因突變則獲得油酸含量由16%增加到50%的籽粒[20]。因此,通過調控FatB的催化活性,可以對花生籽粒飽和脂肪酸的合成進行調控。

本研究擬構建花生AhFatB基因的CRISPR/Cas9編輯載體,并通過農(nóng)桿菌介導的花粉管注射法轉化花生,在成功轉化的基礎上獲得AhFatB位點被成功編輯的花生籽粒,進一步篩選出飽和脂肪酸含量降低的突變材料,旨在為花生基因編輯的有效展開提供依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 花生品種為花育23號,由青島農(nóng)業(yè)大學花生研究中心保存。

1.1.2 菌株、質粒、載體和試劑藥品 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101購自上海唯地生物技術有限公司(Veidi,中國上海)。CRISPR/Cas9載體構建試劑盒購自杭州百格生物技術有限公司(Biogle,中國杭州)。卡那霉素(Kanamycin)、利福平(Rifampin)、乙酰丁香酮(AS)、MES、MgCl2·6H2O、質粒提取試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon,中國上海)。2×Taq Plus Master MixⅡ(Dye Plus)購自南京諾唯贊生物科技有限公司(Vazyme,中國南京)。

1.1.3 引物設計與合成 試驗所用引物及其序列列于表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。CS4-F/CS4-R用于Cas9基因的擴增及測序；A1-F/A1-R用于Aradu.ZG6C0基因的擴增及測序；B1-F/B1-R用于Araip.SBA9Y基因的擴增及測序；U6-F用于靶位點測序；Oligo1、Oligo2用于構建重組載體。

表1 引物及序列Tab.1 Primers and sequences used in experiments

1.1.4 培養(yǎng)基及侵染液 LB液體培養(yǎng)基+50 mg/L 卡那霉素；YEB液體培養(yǎng)基+50 mg/L卡那霉素+50 mg/L利福平；侵染液：MS液體培養(yǎng)基+100 μmol/L 乙酰丁香酮+10 mmol/L MES+10 mmol/L MgCl2·6H2O。

1.2 試驗方法

1.2.1 CRISPR/Cas9編輯載體的構建 設計花生AhFatB編輯位點,根據(jù)靶位點合成1對Oligos(Oligo1和Oligo2，表1),使用杭州百格生物技術有限公司CRISPR/Cas9載體試劑盒,將合成的編輯位點DNA Oligo通過Buffer Anneal連接到PX458載體上(圖1),轉化大腸桿菌DH5α,挑選單克隆菌落,利用CS4-F和CS4-R引物進行PCR擴增驗證,對擴增陽性的菌落利用U6啟動子引物U6-F進行測序驗證。

LB.T-DNA左側；RB.T-DNA右側；U6.大豆U6啟動子；SG.sgRNA(導向RNA)；e35S.35S強啟動子； Cas9.優(yōu)化過的Cas9；NOS Ter.NOS終止子；35S.花椰菜花葉病毒的35S啟動子；Bar.Bar選擇標記基因；PolyA Ter.PolyA終止子。LB.Left border of T-DNA; RB. Right border of T-DNA; U6.Soybean U6 promoter; SG.sgRNA; e35S.Enhanced 35S promoter; Cas9.Optimized Cas9; NOS Ter.NOS terminator; 35S.CaMV 35S promoter; Bar.Bar selection marker gene;PolyA Ter.PolyA terminator.

1.2.2 重組質粒轉化農(nóng)桿菌 取-80 ℃冰箱保存的農(nóng)桿菌于超凈工作臺室溫融化,取100 μL加入2 μL質粒DNA,用手彈打管底混勻,依次于冰上靜置5 min,液氮5 min,37 ℃水浴5 min,冰浴5 min；加入600 μL的無抗生素的YEB液體培養(yǎng)基,于28 ℃搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h；6 000 r/min離心1 min,棄上清液,加入100 μL的無抗生素的YEB液體培養(yǎng)基,槍頭吸打混勻,吸取100 μL的菌液涂布于含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的YEB平板上,倒置培養(yǎng)3 d；挑單克隆進行菌落PCR擴增驗證,保存陽性克隆菌液。

1.2.3 注射浸花法轉化花生 將花育23號成熟種子進行催芽處理后播種于花盆中,每盆4粒,出苗后,保留長勢良好的2棵植株。于花生始花期開始每天早晨摘去尚未完全開放的花朵,持續(xù)7～10 d使其達到盛花期時開始注射。注射前1 d將保存在冰箱中的農(nóng)桿菌菌液取出,吸取200 μL轉入含有50 mg/L卡那霉素和利福平的YEB培養(yǎng)基中,28 ℃,200 r/min,搖菌約10～12 h后,取適量菌液于紫外分光光度計中測量OD600值,待 OD600=0.6～0.8時,先取1 mL菌液保存在4 ℃冰箱待次日搖菌備用,剩余菌液經(jīng)離心后收集沉淀,加入提前制備好的等體積侵染液,充分混勻后得到菌體注射液。注射于當日8:00之前進行,使用1 mL的醫(yī)用注射器吸取注射液注入開放花朵的龍骨瓣內(或者花萼管),連續(xù)注射10 d,之后再連續(xù)摘花7～10 d,對新生果針進行綁繩標記。待莢果發(fā)育成熟后收獲綁繩標記的花生莢果。

1.2.4 收獲籽粒的分子鑒定 取注射后收獲的花生莢果籽粒,使用SDS法提取基因組DNA為模板[21],以CS4-F和CS4-R為引物進行PCR擴增檢測。擴增體系為：總體積25 μL,包括正反向引物各10 μmol/L,2×Taq Plus Master Mix Ⅱ 12.5 μL,DNA模板50 ng。擴增條件為：95 ℃預變性5 min；然后進行35次循環(huán)：95 ℃變性40 s,64 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果,對檢測的陽性籽粒DNA,再用A1-F/A1-R及B1-F/B1-R引物進行擴增后測序,驗證靶位點編輯情況。

2 結果與分析

2.1 CRISPR/Cas9編輯載體的構建

以轉化后的單克隆大腸桿菌為模板,CS4-F、CS4-R為引物進行PCR擴增,擴增出產(chǎn)物為1 249 bp的條帶(圖2-A),說明重組質粒已成功轉入。再取部分陽性克隆送公司測序,測序結果含有靶位點DNA序列的為陽性克隆(圖2-B)。對測序成功的重組載體命名為PX458-Cas9-FatB。

A.重組質粒的PCR擴增驗證：M.DL2000；1.陽性對照(1 249 bp)；2-6.單克隆。B.重組質粒的測序峰圖,橫線部分為靶位點序列。A. PCR amplification verification of recombinant plasmid：M.The molecular weight Marker of DL2000;1. Positive control (1 249 bp); 2-6. Every monoclonal. B. The sequencing peak map of the recombinant plasmid, with the horizontal line as the target sequence.

2.2 重組質粒轉化農(nóng)桿菌

挑選在含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的YEB平板上的單克隆菌落,利用CS4-F、CS4-R引物進行菌落PCR擴增驗證,能擴增出1 249 bp目的片段的均為陽性菌落,說明重組質粒已成功轉入農(nóng)桿菌(圖3)。

M.DL2000；1.空白對照；2.陽性質粒對照；3-7.農(nóng)桿菌單克隆。M.The molecular weight Marker of DL2000; 1.Blank control;2.Positive plasmid control; 3-7.Agrobacterium tumefaciens monoclonal.

2.3 注射浸花法轉化花生

使用1 mL的無菌注射器吸取農(nóng)桿菌注射液,每次吸取之前先將離心管中的注射液搖勻。選擇當日盛開的花朵(圖4-A),從花生花瓣的龍骨瓣處進行注射,一只手拖住花瓣,另一只手持注射器扎破龍骨瓣進行注射(圖4-B),直到花萼管中充滿水柱,并且打開翼瓣后看到注射液浸滿整個花朵(圖4-C)。每朵花大約注射0.1 mL注射液,每天6：00-8：00進行注射,持續(xù)7～10 d。隨后對新生果針進行綁繩標記(圖4-D)。待莢果發(fā)育成熟后收獲綁繩標記的花生莢果(圖4-E、F)。

2.4 注射后收獲籽粒的分子鑒定

圖5結果顯示,注射后收獲的籽粒中,能成功擴增出了相應目的條帶的籽粒含有外源重組質粒,未能擴增出相應條帶的為轉基因陰性籽粒。在被檢測的274粒籽粒中,共檢測獲得108粒陽性籽粒,轉基因陽性率為39.42%。對擴增陽性的108粒籽粒進行測序驗證,發(fā)現(xiàn)有1粒在靶位點外發(fā)生了編輯,在部分陽性籽粒的自交后代中,發(fā)現(xiàn)了靶位點發(fā)生編輯的籽粒。

A.待注射的花朵；B.注射龍骨瓣；C.侵染液包滿雄蕊且在花萼管有一段水柱；D.尼龍繩捆綁果針；E.收獲植株；F.收獲的莢果和籽粒。A.Flowers to be injected; B.Carina injected; C.Infection medium covered with stamens and a column of water in the calyx tube; D. Pod needles tied with nylon cord; E.Harvested plants; F.Harvested pods and seeds.

M.DL2000；1.陽性質粒對照；2.空白對照；3.非轉基因對照；4-34.轉化后收獲的籽粒。M.The molecular weight Marker of DL2000;1.Positive plasmid control;2.Blank control;3.Non-transgenic control;4-34. Seeds harvested after transformation.

3 結論與討論

利用浸花法進行遺傳轉化在擬南芥以及油菜等植物上獲得了巨大成功[22-23]。花生屬于較難轉化的作物,青島農(nóng)業(yè)大學花生研究中心十多年來堅持對該法進行摸索優(yōu)化,建立了簡單高效的注射浸花法遺傳轉化技術。根據(jù)以往經(jīng)驗,影響轉化效率最關鍵的因素是農(nóng)桿菌的活力,因此,注射液必須要現(xiàn)用現(xiàn)配,具體為注射前1 d晚上搖菌,第2天早上離心后用侵染液重懸菌體,用于當日注射效果最好,第2日注射需要第2日早上再重新配置注射液,如使用第1日的注射液,轉化成功率會降低50%～80%。另外在注射過程中,直接注射花萼管雖然可行,但因花萼管較細長,直接用注射器扎破后容易造成花萼管受損折彎,影響受精過程進而降低轉化效率。因此,應該盡量選擇注射龍骨瓣,注射龍骨瓣直到雄蕊被浸透,農(nóng)桿菌可隨著花粉管通道直接進入胚囊而提高轉化效率。有研究者直接利用花粉管注射法轉化外源DNA也能達到很好的轉移效果,但由于同時導入大片段的序列而引起受體很多基因及性狀的改變,而直接注射農(nóng)桿菌可以保證外源基因的單一進入而增加了轉化后代的定向選擇效果。因此,使用注射浸花法,將攜帶外源基因的重組農(nóng)桿菌通過花粉管通道完成整個轉化過程,與其他的遺傳轉化方法相比較,該法不需要依賴其他設備,操作簡單,可以大大降低成本和節(jié)約時間。利用此法將花生nsLTPs、Lea-D、WRKY75等基因導入花生,分別獲得35%～56%的陽性轉化率[24-25]。如果能夠更好地控制摘花時間,而且即時標記果針,預計可提高轉化率到70%以上。本研究首次使用該轉化方法進行CRISPR/Cas9基因編輯,雖然產(chǎn)生較高的陽性籽粒(39.42%),但是經(jīng)測序結果驗證,只有1粒在靶位點外發(fā)生編輯,說明應用此法未能實現(xiàn)高效率的基因編輯。有報道說非同源性的啟動子會抑制編輯效率[26],本研究使用了大豆的U6啟動子對花生進行了編輯,這種非同源性的差異可能是造成編輯效率低的原因之一,目前正在嘗試用花生的啟動子來替代大豆U6啟動子來提高編輯效率。此外,FatB基因在植物的發(fā)育過程中起到非常重要的作用[19-20],基因被編輯失活可能會影響到種子的正常發(fā)育而被選擇淘汰,因而顯示出極低的編輯效率。高效的注射浸花法轉化技術是否能更有效地用于花生基因編輯,仍需進一步的研究證實。