大豆關聯重組自交系群體蛋白質、油分含量的QTL分析

田 雨,王艷殊,張佳楠,許世超,董全中,李文濱,李文霞,寧海龍

(1.東北農業大學 農學院,大豆生物學教育部重點實驗室,農業部東北大豆生物學與遺傳育種重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農業科學院 克山分院,黑龍江 克山 161606)

大豆(Glycinemax(L.) Merr.)是重要的食用油和植物蛋白的來源,在農業和經濟生產中占據舉足輕重的地位,提高油分含量和蛋白質含量是大豆育種的主要目標。為了加快育種進程,分子標記技術定位QTL已廣泛應用于大豆蛋白質和油分含量的遺傳育種研究中,國內外關于大豆蛋白質和油分含量QTL定位的報道已有很多,控制蛋白質和油分性狀的 QTL 基本分散在 20條染色體上[1-4]。1992 年,Diers等[5]利用A81356022×PI468916雜交得到F2∶3單株60個,定位了8個蛋白質和9個油分含量 QTL。 1996 年Lee等[6]利用 Young×PI 416937 雜交得到124個株系的F4分離群體定位了 13 個蛋白質和 6 個油分含量 RFLP 位點,另外,利用 PI 97100×COKER 237 雜交得到111個株系F2的分離群體定位了6個蛋白質和5個油分含量RFLP位點。 2011年,葛振宇等[7]以栽培大豆TK780 與野生大豆 Hidaka4 雜交得到包含96 個株系的重組自交系(RILs),利用該群體定位了 2 個蛋白質含量 QTL和3 個油分含量 QTL。 2013年,Rossi等[3]利用來自加拿大和中國的2個品種OAC Millenium和黑農38雜交得到92個株系的F4∶7RIL群體,定位了4個油分和4個蛋白含量QTL。2010年,Liang等[8]利用晉豆 23×Huibuzhi得到含有474個株系的F13RIL群體,利用SSR標記分析共定位到5個蛋白質含量和6個油分含量QTL。2012年,Wang等[2]利用SD02-4-59×A02-381100得到含有87個株系的F5RIL群體,利用SSR和SNP標記分析共定位到9個油分含量QTL。 2003年,Chung等[9]利用A3733×P1437088A得到包含75個株系的F5RIL群體,利用SSR標記分析定位到一個蛋白和一個油分含量QTL,位于連鎖群I上。2014年,Wang等[10]利用2個群體SD02-4-59 ×A02-381100和 SD02-911×SD00-1501,共定位到16個油分含量和11個蛋白含量QTL。2015年, Han等[11]利用中豆 27×九農 20得到RIL群體,定位到9個蛋白質含量和9個油分含量QTL。截至目前,Soybase 網站(www.soybase.org)統計了241個蛋白含量的 QTL 位點,320 個油分含量的 QTL 位點。

綜上所述,國內外定位的蛋白質和油分含量QTL數量很多,但多是運用單一環境進行兩親本衍生的群體定位,同時蛋白質和油分含量表現為數量性狀,其遺傳基礎復雜,這可能使遺傳發生較高的偏分離,從而降低遺傳作圖精度。本研究應用前期構建的關聯重組自交系群體,關聯重組自交系群體中由于含有共同的親本(東農L13),突破了以往單一親本的限制,可以增加后代的多態性以及變異率,使后代在具有更高變異的同時還可以使2個遺傳圖譜間緊密聯系,提高作圖精度,拓展圖譜豐富度,在研究大豆蛋白質和油分QTL時降低了定位誤差,從而提高主效QTL的真實性。

1 材料和方法

1.1 關聯重組自交系的構建

2008年用品質性狀差異較大的大豆親本東農L13(蛋白質含量45.50%,油分含量18.74%)、合農60(蛋白質含量38.47%,油分含量22.25%)和黑河36(蛋白質含量39.8%,油分含量19.28%),配制2個雜交組合,分別獲得東農L13×合農60的F1和L13×黑河36的F1,將F1自交,自F2世代,在每一單株按單粒傳法摘粒,在哈爾濱和海南島連續自交5代,獲得關聯重組自交系群體。東農L13×黑河36衍生的重組自交系群體(RIL3613)包含134個家系,東農L13×合農60衍生的重組自交系群體(RIL6013)包含156個家系,用于本研究的蛋白質和油分含量QTL初步定位。

1.2 田間試驗與性狀調查

分別于2013,2014,2015年分別在黑龍江省克山和哈爾濱進行田間試驗。將3個親本和2個 RIL在田間種植,其中親本種植40株,田間試驗采取隨機區組試驗設計,3次重復,每小區3行,行長3 m,行距0.7 m,株距0.07 m。田間管理同一般大田栽培。成熟后收獲種子應用Perton8620近紅外品質分析儀測定蛋白質含量和油分含量[12]。

1.3 數據分析方法

對多年多點條件下蛋白質和油分含量數據進行描述性分析,并使用SAS 9.1軟件對不同環境下的表型觀測值進行聯合方差分析,估算相應的方差分量,通過遺傳方差、基因型與環境互作方差和誤差方差進行遺傳率的估計,遺傳率估計的計算方法如下：

1.4 QTL定位分析

基于前期研究構建的連鎖圖譜[13],對各環境的蛋白質和油分含量分別采用完備復合區間作圖法進行QTL定位,其統計分析過程通過IciMapping軟件實現。背景標記選擇的概率標準為0.001,染色體掃描步長為1 cM,LOD值得全基因組臨界值由排列法(Permutation)確定,重復次數為1 000次,第一類錯誤的臨界值為0.05,最小臨界值為2.5。

2 結果與分析

2.1 表型數據分析

對3個環境下蛋白質和油分含量的分析(表1)可看出,在RIL3613和RIL6013的蛋白質含量和油分含量存在較大的變異,2個群體的蛋白質含量和油分含量在基因型間或不同環境條件下差異均達極顯著水平,且環境和基因型之間存在極顯著的互作效應。蛋白質和油分性狀在兩群體中均表現為連續分布(圖1),表明蛋白質含量和油分含量這2個性狀是受多基因控制的數量性狀,在E1環境下,RIL6013群體油分含量高于RIL3613群體油分含量,RIL3613群體在E2環境下油分含量高于E1環境,兩群體在E3環境下油分和蛋白質含量均表現較為集中。因此,可用該群體進行QTL定位研究,并且不同環境下定位結果可能發現不同的QTL。

表1 不同環境下2個群體蛋白質和油分含量的方差分析Tab.1 Analysis of variance on protein and oil contents across multiple environments in RIL

E1.克山2013；E2.哈爾濱2014；E3.哈爾濱2015。E1.Keshan in 2013；E2.Harbin in 2014；E3.Harbin in 2015.

2.2 蛋白質含量的 QTL 定位

本試驗在3個環境中檢測到控制大豆蛋白質含量QTL共8個,定位在大豆的7個連鎖群上(表2),在RIL3613群體中檢測到6個蛋白質含量相關 QTL,分布于連鎖群O、B1、F、D2、L、I、G上,LOD值分別為3.11,2.60,4.06,3.04,3.89和4.77,貢獻率分別為11.53%,11.76%,7.93%,7.29%,12.11%和7.56%,其中qPro-O-1、qPro-B1-1、qPro-I-1的貢獻率高于10%，加性效應分別為1.31,0.38,-0.91,0.82,1.12和0.60,其中,qPro-O-1、qPro-B1-1、qPro-L-1、qPro-I-1和qPro-G-1的正向加性效應來自于親本東農L13,而qPro-D2-1的正向加性效應來自于親本黑河36。在RIL6013群體中檢測到2個蛋白質含量相關的QTL,分布于連鎖群O、F上,LOD值分別為2.65和3.04,貢獻率分別為6.53%和9.26%,加性效應分別為0.76和-0.71,其中,qPro-O-2的正向加性效應來自于親本東農L13,而qPro-F-1的正向加性效應來自于親本合農60。

表2 不同環境下蛋白質含量QTL定位結果Tab.2 QTLs underlying protein content in soybean detected in different environments

2.3 油分含量的 QTL 定位

在3個環境中檢測控制大豆油分含量QTL 5個(表3),定位在大豆的5個連鎖群上,在RIL3613群體中檢測到2個油分含量相關QTL,分布于連鎖群D1a和A2上,LOD值分別為3.16和5.67,貢獻率分別為9.95%和17.73%,加性效應分別為-0.23和-0.38,正向加性效應來自于親本黑河36,其中,qOil-A2-1可以同時在2013年克山和2014年哈爾濱的2個環境中檢測到為多環境通用QTL。在RIL6013群體中檢測到3個油分含量相關QTL,分布于連鎖群C1、H和D2上,LOD值分別為3.61,2.75和5.33,貢獻率分別為11.84%,5.72%和13.62%,加性效應分別為-0.40,-0.27和-0.43,正向加性效應來自于親本合農60。兩群體共檢測到貢獻率高于10%的QTL有3個，分別為qOil-C1-1、qOil-A2-1、qOil-D2-1。

表3 不同環境下油分含量QTL定位結果Tab.3 QTLs underlying oil content in soybean detected in different environments

3 討論

在以往的QTL定位群體中,多是應用單個雙親本衍生的群體,由于分子標記的多態性的原因,使構建的遺傳圖譜難以覆蓋全基因組區域,因此,也不可能發現遺漏基因組區域上的QTL。為覆蓋不同基因組區域,可采用同一個親本與多個親本雜交衍生的關聯重組自交系群體進行圖譜構建,通過不同親本與共同親本間分子標記的多態性以增加基因組的覆蓋范圍,進而提高QTL發掘能力。Buckler等[14]構建了包含25個玉米株系的RIL群體的關聯重組自交系群體,對玉米開花期性狀進行研究,在2個群體中共同發現了大量的微效QTL。李君[15]構建了包含2個小麥RIL的關聯重組自交系群體進行QTL檢測,其中有13對 QTL 在 2 個 RIL 群體中被同時定位或具有相同的連鎖標記區間。本研究采用東農L13作為共同親本與合農60和黑河36分別雜交,構建了包含2個RIL 群體的關聯重組自交系群體進行蛋白質和油分含量的QTL定位。應用RIL3613定位了6個蛋白質含量QTL,而RIL6013定位了2個蛋白質含量QTL。這2個群體定位的QTL在不同的基因組區域,說明應用關聯群體可提高QTL的發現能力。

通過比較含有不同遺傳背景的QTL的基因組區域,結果發現,O連鎖群上的蛋白質QTL(qPro-O-1)基因組所在的區域為5.44(Satt358)～20.93 cM(Sat_303)已經定位1個蛋白質含量QTL和1個油分含量QTL[4,16],O連鎖群上的另一個蛋白質QTL(qPro-O-2)基因組所在的區域為20.93(Sat_303)～56.93 cM(Satt633),已經定位1個蛋白質含量QTL和3個油分含量QTL[12,17-19]。B1連鎖群上的蛋白質QTL(qPro-B1-1) 基因組所在的區域46.38(Satt197)～102.55 cM(Satt359),已經定位3個蛋白質含量QTL和1個油分含量QTL[4,20-21]。F連鎖群上的蛋白質QTL (qPro-F-1)基因組所在的區域為27.87(Sat_039)～135.94 cM(Sat_417),已經定位8個蛋白質含量QTL和5個油分含量QTL[2-3,12,16,21-25]。D2連鎖群上的蛋白質QTL (qPro-D2-1)基因組所在的區域為92.12(Sat_001)～112.84 cM(Sat_326),已經定位3個蛋白質含量QTL和4個油分含量QTL[8,11-12,19-20]。L連鎖群上的蛋白質QTL (qPro-L-1)基因組所在的區域為28.27(Sat_134)～32.00 cM(Sat_191),在標記Sat_134處與Mao等[12]定位的油分含量QTL有相同的標記,但是否為同一QTL 有待進一步驗證。Ⅰ連鎖群上的蛋白質QTL (qPro-I-1)基因組所在的區域為27.98(Satt367)～50.11 cM(Satt270),已經定位14個蛋白質含量QTL和12個油分含量QTL[4-5,9-11,22,26-30]。D1a連鎖群上的控制油分含量的QTL (qOil-D1a-1)基因組所在的區域為8.23 (AZ254740)～55.68 cM(Satt515),已經定位1個蛋白質含量和1個油分含量QTL[11,22]。A2連鎖群上的控制油分含量的QTL (qOil-A2-1)基因組所在的區域為14.99(Sct_067)～33.95 cM(Satt589),與Qi等[4]在A2連鎖群上的油分含量QTL在大豆公共圖譜上相距很近,可以認為是同一個QTL。D2連鎖群上的控制油分含量的QTL (qOil-D2-1)基因組所在的區域為5.38(Sat_333)～86.69 cM(Sat_194),已經定位3個蛋白質含量QTL和11個油分含量QTL[4,6,10-12,15,23]。以上 QTL 與前人的定位結果相一致,是多個遺傳背景通用的QTL。但蛋白質QTL(qPro-G-1)和油分含量QTL (qOil-C1-1、qOil-H-1)在公共圖譜上并未發現與之重疊區域,是RIL3613和RIL6013的特異性QTL位點,可為以后的分子育種奠定基礎。

國內外關于大豆蛋白質含量、油分含量QTL的研究日益增多,研究方法也有所不同,但在以往研究多是利用單環境的數據進行分析,由于蛋白質和油分含量多表現為數量性狀,易受環境條件的影響,這將導致一些QTL由于LOD值較高而未被檢測到或是出現假陽性。Wang等[10]利用2個重組自交系群體,共定位到12個產量性狀,16個油分含量和11個蛋白質含量多環境通用QTL。侯萌等[31]構建了包含147個株系的重組自交系群體,進行油分和蛋白質含量的QTL分析,6個環境下共定位到9個蛋白質含量QTL和11個油分含量QTL,其中有2個油分含量QTL為多環境通用QTL。Ning等[13]利用包含204個株系的大豆4項重組自交系群體,共檢測到29個蛋白質含量QTL和39個油分含量QTL,分別有5個蛋白質和10個油分QTL為多環境通用QTL。應用多環境的數據分析,可以同時發現環境特異QTL和多環境通用QTL,較準確估計 QTL 的效應,更有利于搜索穩定的QTL。本研究共檢測到1個油分含量QTL為多環境通用QTL,12個QTL為單個環境特異QTL。

在以往進行QTL的研究中,多研究主效QTL,即貢獻率值高于10%的QTL。葛振宇等[7]利用包含96個株系的RIL群體,進行油分和蛋白質含量的QTL分析,定位到2個蛋白質含量和3個油分含量QTL,且貢獻率均高于10%。侯萌等[31]構建了包含147個株系的重組自交系群體,進行油分和蛋白質含量的QTL分析,共定位到9個蛋白質含量QTL和11個油分含量QTL,其中有6個蛋白質含量和7個油分含量QTL 貢獻率高于10%。本研究有3個蛋白質QTL和3個油分含量QTL的貢獻率高于10%,這些QTL具有重要的潛在價值,可以對其進行精細定位,為相應基因的圖位克隆奠定基礎。

本試驗定位出了8個蛋白質含量QTL與5個油分含量QTL,有1個蛋白質QTL和2個油分含量QTL為本研究群體特異性QTL；有1個油分含量QTL為多環境通用QTL,其他12個QTL為單個環境特異QTL；在本研究中,有3個蛋白質QTL和3個油分含量QTL為主效QTL,可進行分子設計育種研究。