野生角瓜根結(jié)線蟲抗性相關(guān)基因CmWRKY20的克隆與表達(dá)分析

葉德友，姜 野，王從麗

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，甘肅 蘭州 730070；2.中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081)

根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.，RKN)是危害黃瓜(CucumissativusL.，2n=14)生產(chǎn)的重要病原，目前,國內(nèi)外尚無抗南方根結(jié)線蟲(M.incognita)的黃瓜品種應(yīng)用于生產(chǎn)，對根結(jié)線蟲缺乏有效的防控措施[1-2]。利用轉(zhuǎn)錄因子來改良植物抗病性是一種高效、快捷而頗具潛力的分子育種途徑，對于揭示植物的抗病機(jī)理也具有重要作用。WRKYs是植物中廣泛存在的一類轉(zhuǎn)錄因子，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過與基因啟動子特異性結(jié)合激活或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，WRKY 蛋白通過調(diào)控多通路多層次的抗病信號途徑參與植物對病原物的防衛(wèi)反應(yīng)[3-4]。已有研究表明，植物對線蟲的抗病性或感病性取決于抗性基因(R)、植物激素(Phytohormone)以及活性氧(ROS)等信號傳導(dǎo)通路間的交互協(xié)調(diào)，WRKYs作為關(guān)鍵的調(diào)控因子通過轉(zhuǎn)錄參與了信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控[5-6]。Ling等[7]在黃瓜基因組中鑒定了55個(gè)WRKY基因，發(fā)現(xiàn)23個(gè)CsWRKY響應(yīng)干旱、高鹽、低溫3種非生物脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。張雅涵[8]從侵染根結(jié)線蟲的黃瓜材料9930根系中分離到了24個(gè)WRKY基因，認(rèn)為WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與了根結(jié)線蟲取食位點(diǎn)早期形成及根結(jié)的生長發(fā)育調(diào)控。WRKYs轉(zhuǎn)錄因子對于黃瓜-根結(jié)線蟲互作的調(diào)控體系研究具有重要的理論意義，將為黃瓜根結(jié)線蟲病害的發(fā)生、發(fā)病機(jī)理在系統(tǒng)層次上的研究提供重要線索。更為重要的是，通過研究WRKYs在黃瓜-根結(jié)線蟲非親和互作中的調(diào)控功能，可為采用WRKYs的遺傳操作來改良黃瓜的根結(jié)線蟲抗性提供技術(shù)支撐，對于根結(jié)線蟲病害防控具有重要的實(shí)踐價(jià)值和潛在的應(yīng)用前景。迄今，從黃瓜根結(jié)線蟲抗源材料中克隆抗性基因及轉(zhuǎn)錄因子的研究國內(nèi)外鮮見報(bào)道。

野生資源攜帶有栽培作物亟需的優(yōu)異基因。角瓜(C.metuliferusNaud.，2n=24)為原產(chǎn)非洲的黃瓜屬(Cucumis)近源野生物種，野生角瓜對根結(jié)線蟲的優(yōu)異抗性得到了黃瓜遺傳學(xué)家的普遍關(guān)注[9-12]，對此國內(nèi)外學(xué)者在黃瓜屬內(nèi)開展了廣泛的種間雜交，然而如何獲得可育的種間雜種F1成為限制野生角瓜進(jìn)一步利用的瓶頸問題。近年來基于RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)，野生角瓜根系中與根結(jié)線蟲抗性相關(guān)的水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)信號傳導(dǎo)與防衛(wèi)基因顯著差異表達(dá)[12]，但其深入的作用機(jī)制尚不明晰。野生角瓜對根結(jié)線蟲的抗性是否與SA/JA信號傳導(dǎo)有關(guān)，WRKY是否參與了角瓜根結(jié)線蟲抗性中SA/JA信號通路的調(diào)控等諸多問題亟需深入研究。本研究擬從野生角瓜根系中篩選克隆與根結(jié)線蟲抗性密切相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并進(jìn)行基因表達(dá)分析與編碼蛋白的亞細(xì)胞定位，為闡明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在角瓜根結(jié)線蟲抗性中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為黃瓜抗線蟲品種的遺傳改良提供基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 野生角瓜品系CmR07和CmS12，二者分別對南方根結(jié)線蟲高抗、高感[12]。采用穴盤育苗，將育苗基質(zhì)(沙∶泥炭土=2∶1)經(jīng)120 ℃高溫滅菌2 h后裝入穴盤，種子用0.1%HgCl2表面消毒15～20 min后催芽播種，待幼苗長至兩葉一心時(shí)接種南方根結(jié)線蟲，線蟲接種在溫室番茄上常年繁殖保存。線蟲處理組CmR07和CmS12均設(shè)6個(gè)處理，分別為接種后2，4，7，14，21，28 d，線蟲接種量為1 000 J2/株；SA與MeJA均設(shè)4個(gè)處理濃度，SA濃度分別為0.1，0.5，1.0，2.0 mmol/L，MeJA濃度分別為0.05，0.10，0.50，1.00 mmol/L，以清水處理作對照。采集各處理的材料樣品，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.1.2 酶及生化試劑 RACE試劑盒(SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit，Clontech)、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit 和PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser)、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒、pMD18-T vector、dNTPs、LATaq、DL2000 Marker DNA 等購自寶生物工程(大連)有限公司，引物合成及菌液測序均由上海生工有限公司完成。植物RNA提取試劑盒(RK16-50T)、PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒、質(zhì)粒大抽試劑盒(Plasmid Maxiprep Kit，Sigma-Aldrich)購自天根生物公司，其他相關(guān)生化試劑均為分析純國產(chǎn)試劑。

1.1.3 菌株及載體 克隆載體pMD19-T Vector、載體pCAMBIA1301、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，農(nóng)桿菌LBA4404、載體pBI121以及亞細(xì)胞定位載體pH7FWG2.0于-20 ℃冰箱中保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取與cDNA合成 采用植物RNA快速提取試劑盒(RK16-50T)提取角瓜根系樣品RNA，提取好的RNA通過0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，采用SMA3000進(jìn)行RNA濃度與純度測定，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2CmWRKY20基因全長的克隆 根據(jù)RNA-Seq測序結(jié)果并與黃瓜基因組數(shù)據(jù)比對獲得保守序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成一對特異引物B541F1和B541R1(表1)。以角瓜根系cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增角瓜CmWRKY20特異片段。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：cDNA 5.0 μL，2×Buffer (TaKaRa) 25.0 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1.0 μL，EasyTaq(TaKaRa) 1.0 μL，10 μmol/L上下游引物各1.5 μL和ddH2O 15.0 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收目的片段，純化后的PCR產(chǎn)物克隆后，挑取陽性克隆經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后測序。

根據(jù)基因特異引物PCR擴(kuò)增得到的同源保守序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成3條特異性5′ RACE引物GSP1、GSP2和GSP3以及2條特異性3′ RACE引物C386-1和C386-2(表1)，然后分別進(jìn)行5′ RACE和3′ RACE擴(kuò)增。5′ RACE步驟：使用SUPERSCRIPT Ⅱ RT 酶和引物GSP1對總RNA進(jìn)行目的基因第一鏈cDNA的合成，使用RNase Mix對合成的cDNA進(jìn)行去RNA處理，使用GLASSMAX DNA isolation spin cartridges對cDNA進(jìn)行純化，使用TdT酶和dCTP對純化后的cDNA末端加上多聚C，使用引物GSP2和試劑盒中的橋連鉚釘引物AAP對已經(jīng)加dC尾的cDNA進(jìn)行PCR第1輪擴(kuò)增，使用引物GSP3和試劑盒中的橋連通用擴(kuò)增引物AUAP進(jìn)行巢式PCR第2輪擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳并對目的條帶進(jìn)行切膠回收純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18T連接，轉(zhuǎn)化后對陽性克隆進(jìn)行測序。3′ RACE步驟：使用逆轉(zhuǎn)錄酶SMARTScribeTMReverse Transcriptase 和引物3′ CDS primer A對總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用引物C386-1和UPM，以上面合成的cDNA為模板進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍，然后用引物C386-2和UPM進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳并對目的條帶進(jìn)行切膠回收純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18T連接，轉(zhuǎn)化后直接測序。

根據(jù)中間片段序列、5′ RACE和3′ RACE試驗(yàn)結(jié)果，拼接出目的基因的全長cDNA序列，然后通過NCBI比對分析預(yù)測出基因的起始和終止密碼子位置。目的基因全長ORF驗(yàn)證：根據(jù)拼接出的目的基因全長cDNA序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成一對ORF全長擴(kuò)增引物QB541F1和QB541R1(表1)，以角瓜根系cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序以及克隆測序同上。

表1 引物名稱及序列Tab.1 The name and sequence of primers used in this study

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用DNAStar預(yù)測目的基因的開放讀碼框(ORF)及其編碼的氨基酸序列，通過ExPASy-Compute pI/Mw計(jì)算等電點(diǎn)和分子量，利用NCBI上的BlastP進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索，采用DNAMAN 進(jìn)行氨基酸序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，分別用InterProScan和PSORT預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和核定位信號。

1.2.4 qRT-PCR分析 根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，采用SYBR GREEN染料法，以Ef1α為內(nèi)參基因，做相對定量檢測。PCR反應(yīng)體系：2×SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，cDNA 模板1 μL，10 μmol/L上下游引物各0.8 μL，滴加ddH2O至20 μL。定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火34 s，40次循環(huán)；72 ℃延伸45 s。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)，根據(jù)所得到的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.2.5 CmWRKY20蛋白的亞細(xì)胞定位 根據(jù)CmWRKY20基因的ORF序列，采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，設(shè)計(jì)帶有NcoⅠ(CCATGG)和SpeⅠ(ACTAGT)酶切位點(diǎn)的上游和下游引物，擴(kuò)增目的基因的編碼序列并克隆至pCAMBIA1302-GFP載體，獲得pCAMBIA1302-CmWRKY20-GFP重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Top10克隆菌株。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法浸染煙草，以pCAMBIA1302-GFP為對照，pCAMBIA1302-CmWRKY20-GFP為試驗(yàn)組，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EHA105農(nóng)桿菌菌株，PCR驗(yàn)證陽性后，進(jìn)行煙草葉片轉(zhuǎn)染。注射葉片培養(yǎng)3 d后，取葉片制片使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 CmWRKY20的克隆與分析

根據(jù)角瓜RNA-Seq測序結(jié)果并與黃瓜、甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫比對設(shè)計(jì)一對特異引物，以野生角瓜根系cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一條長度約為820 bp的特異條帶(圖1-A)。測序表明，該片段與黃瓜、甜瓜、苦瓜等物種的WRKY20具有較高的保守性，表明該片段是WRKY在野生角瓜中的同源基因片段。基于此同源基因片段，設(shè)計(jì)5′-RACE和3′-RACE引物進(jìn)行RACE克隆，分別獲得長度約為590 bp(圖1-B)和290 bp(圖1-C)的條帶，然后拼接出目的基因的全長cDNA序列，并以此設(shè)計(jì)一對ORF全長引物進(jìn)行驗(yàn)證，通過PCR擴(kuò)增獲得一條長度約為1 000 bp的片段(圖1-D)。經(jīng)測序分析后發(fā)現(xiàn)，該序列cDNA全長1 603 bp，5′非翻譯區(qū)646 bp，3′非翻譯區(qū)320 bp，ORF長度為1 017 bp，編碼一個(gè)由338個(gè)氨基酸組成、分子量為38.24 ku、等電點(diǎn)為9.58的蛋白質(zhì)，命名為CmWRKY20，序列提交到GenBank(登錄號為MN365875)。

A.特異片段擴(kuò)增產(chǎn)物；B. 5′ RACE擴(kuò)增片段；C. 3′ RACE擴(kuò)增片段；D.ORF全長擴(kuò)增片段；1-4.PCR 產(chǎn)物；M.DL2000 Marker。A.Amplification product of specific fragment；B.Amplification fragment of 5′ RACE； C. Amplification fragment of 3′ RACE；D.ORF full length amplification fragment；1-4.PCR product；M.DL2000 Marker.

2.2 CmWRKY20的氨基酸序列與系統(tǒng)進(jìn)化

利用InterProScan對CmWRKY20編碼的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明，CmWRKY20具有WRKY家族的結(jié)構(gòu)特征：第414-446位氨基酸為鋅指結(jié)構(gòu)域，鋅指基序?yàn)镃2H2型，第394-400位氨基酸為WRKY結(jié)構(gòu)域(WRKYGQK)，根據(jù)Eulgem等[13]的分類原則將CmWRKY20歸類于第Ⅱ組。經(jīng)PSORT預(yù)測，CmWRKY20在第365-370位氨基酸有核定位信號KKRKHR。從NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(Nr)中下載了與CmWRKY20蛋白同源的7條蛋白序列，其物種名稱、序列登錄號及其氨基酸序列相似性分別為：黃瓜(Cucumissativus，XP_004154104.1，94.25%)、甜瓜(Cucumismelo，XP_008449343.1，93.29%)、黃瓜(Cucumissativus，XP_011649180.1，91.38%)、苦瓜(Momordicacharantia，XP_022146052.1，76.40%)、中國南瓜(Cucurbitamoschata，XP_022963451.1，73.75%)、印度南瓜(Cucurbitamaxima，XP_022967410.1，73.16%)、瓠瓜(Cucurbitapeposubsp.pepo，XP_023554095.1，73.16%)，通過DNAMAN 將CmWRKY20與7條蛋白序列進(jìn)行比對，氨基酸序列的同一性為83.97%，表明上述蛋白具有極高的序列相似性(圖2)。

圖2 角瓜CmWRKY20 與其他葫蘆科作物WRKY蛋白氨基酸序列同源性比對Fig.2 Amino acid sequence homology alignment of CmWRKY20 in C.metuliferus and WRKY proteins from other cucurbitaceae crops

利用DNAMAN 8.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，野生角瓜CmWRKY20與黃瓜(XP_004154104.1)、黃瓜(XP_011649180.1)、甜瓜(XP_008449343.1)親緣關(guān)系較近，說明它們同屬(黃瓜屬)不同種的關(guān)系，而與葫蘆科其他屬的作物如苦瓜(XP_022146052.1)、瓠瓜(XP_023554095.1)、印度南瓜(XP_022967410.1)、中國南瓜(XP_022963451.1)親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)(圖3)。

2.3 CmWRKY20在接種線蟲和激素處理后的表達(dá)

提取角瓜不同組織中的總RNA，以角瓜Ef1α基因作內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果表明，CmWRKY20表達(dá)表現(xiàn)為抗病材料CmR07高于感病材料CmS12，根、莖高于葉片(圖4-A)；根結(jié)線蟲侵染后，CmR07中CmWRKY20的表達(dá)先降低后升高，在接種后14 d開始升高并于接種后28 d出現(xiàn)大幅增加，CmWRKY20在28 d的相對表達(dá)量顯著高于其他接種時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，而CmS12中CmWRKY20的表達(dá)則表現(xiàn)為在接種根結(jié)線蟲后逐漸降低并于接種后21 d出現(xiàn)小幅增加但在28 d又回落(圖4-B)；無論抗病材料還是感病材料，當(dāng)SA處理濃度低于1.0 mmol/L時(shí)，CmWRKY20表達(dá)隨著SA處理濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，但當(dāng)SA處理濃度超過1.0 mmol/L時(shí)迅速降低(圖4-C)，而施用MeJA則使CmWRKY20表達(dá)逐漸降低，當(dāng)MeJA處理濃度超過0.1 mmol/L時(shí)，CmWRKY20表達(dá)降低(圖4-D)；無論CmR07還是CmS12，根系噴施SA與MeJA后，PAL、AOS基因的表達(dá)隨SA、MeJA處理濃度的增大而先逐漸增強(qiáng)，但當(dāng)SA和MeJA處理濃度超過0.5 mmol/L時(shí)，PAL、AOS基因的表達(dá)逐漸降低(圖4-E、F)。

圖3 角瓜CmWRKY20與其他葫蘆科作物WRKY 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic evolutionary analyses of CmWRKY20 in C. metuliferus and WRKY proteins from other cucurbitaceae crops

不同小寫字母表示同一品種不同部位或不同處理間基因相對表達(dá)量在0.05水平上差異顯著。Different lowercase letters indicate significant differences for gene relative expression of the same variety in different organs or treatments at 0.05 level.

2.4 CmWRKY20蛋白的亞細(xì)胞定位

通過GFP和GFP：CmWRKY20 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片，將注射的葉片下表面擦干凈，用不銹鋼手術(shù)刀切下侵染的葉片，置于載玻片上，并滴加1～2滴ddH2O，使葉片平鋪在載玻片上，蓋好蓋玻片，用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光信號監(jiān)測，觀察綠色熒光在煙草表皮細(xì)胞內(nèi)的分布。觀察結(jié)果如圖5，GFP熒光表達(dá)顯示綠色熒光蛋白在煙草細(xì)胞膜和細(xì)胞核上均有表達(dá)，GFP：CmWRKY20融合蛋白熒光表達(dá)顯示綠色熒光蛋白在細(xì)胞膜上有表達(dá)，說明CmWRKY20編碼蛋白定位于細(xì)胞膜上。

圖5 GFP(A-C)和CmWRKY20(D-F)在本生煙葉片中的瞬時(shí)表達(dá)Fig.5 Transient expression of GFP (A-C) and CmWRKY20 (D-F) in N.benthamiana leaves

3 結(jié)論與討論

黃瓜栽培種內(nèi)根結(jié)線蟲抗源匱乏，角瓜與酸黃瓜(C.hystrixChakr.，2n=24)是在黃瓜屬內(nèi)發(fā)現(xiàn)的為數(shù)不多的對南方根結(jié)線蟲具有抗性的野生資源，促進(jìn)了黃瓜根結(jié)線蟲研究工作的深入開展[2，14]。角瓜對根結(jié)線蟲的抗性特征主要表現(xiàn)為：線蟲侵入減少、線蟲生長發(fā)育受到抑制以及細(xì)胞過敏性壞死[10-12]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，角瓜對根結(jié)線蟲的抗性與編碼木質(zhì)素以及植物抗毒素的合成、抗性蛋白的積累相關(guān)基因的表達(dá)以及一些轉(zhuǎn)錄因子的激活密切相關(guān)[12]。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，生長素(Auxin)與細(xì)胞周期(Cell cycle)基因的下調(diào)表達(dá)以及編碼細(xì)胞壁相關(guān)蛋白基因的高表達(dá)導(dǎo)致根系中巨型細(xì)胞異常發(fā)育，阻礙了根結(jié)線蟲的生長發(fā)育，從而引起了酸黃瓜對南方根結(jié)線蟲的抗性。這些研究說明，黃瓜屬不同抗源對根結(jié)線蟲的抗性機(jī)制存在差異。

SA與JA是重要的抗性信號物質(zhì)，在植物-線蟲互作中發(fā)揮重要作用[6]。Molinari等[16]研究發(fā)現(xiàn)，SA信號參與了Mi-1介導(dǎo)的番茄根結(jié)線蟲抗性，JA負(fù)向調(diào)控根結(jié)線蟲抗性，SA/JA信號在Mi-1介導(dǎo)的番茄根結(jié)線蟲抗性中相互拮抗，與SA/JA合成和防衛(wèi)相關(guān)的基因可促進(jìn)或抑制番茄對根結(jié)線蟲的基礎(chǔ)抗性。劉雪嬌[17]研究發(fā)現(xiàn)，與SA、JA合成相關(guān)的基因PAL、ICS、LOX和AOC在漸滲系10299FA(對根結(jié)線蟲具有抗性) 受根結(jié)線蟲侵染后持續(xù)上調(diào)表達(dá)。與此不同，本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的外源SA 和MeJA 增強(qiáng)了SA/JA 信號傳導(dǎo)基因NPR1、PAL、AOS的表達(dá)，而高濃度處理則使NPR1、PAL、AOS的表達(dá)同步降低，說明SA/JA 信號交互調(diào)控與施用劑量有關(guān)[18]。其中NPR1為SA信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)控基因，而PAL、AOS分別與SA、JA合成相關(guān)，這些基因均與植物對逆境脅迫的基礎(chǔ)防衛(wèi)相關(guān)，這一結(jié)果與Thaler等[19]、Kazan等[20]的研究結(jié)果相一致。在角瓜與根結(jié)線蟲互作中，SA與JA對CmWRKY20表達(dá)既有協(xié)同效應(yīng)又有拮抗作用，初步確定SA(1.0 mmol/L)和MeJA(0.1 mmol/L)是引起角瓜根結(jié)線蟲抗性協(xié)同效應(yīng)與拮抗作用的臨界閾值。

在植物與線蟲互作中，一些研究證實(shí)WRKY參與了線蟲防衛(wèi)反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[21-24]。黃瓜對根結(jié)線蟲較為敏感，張雅涵[8]利用RT-PCR從侵染根結(jié)線蟲的黃瓜材料9930根組織中分離到24個(gè)WRKY基因，通過qPCR發(fā)現(xiàn)8個(gè)WRKY基因上調(diào)表達(dá)，2個(gè)WRKY下調(diào)表達(dá)，認(rèn)為黃瓜根結(jié)線蟲取食位點(diǎn)早期形成受多個(gè)WRKY基因的復(fù)雜調(diào)控。為鑒定WRKY轉(zhuǎn)錄因子在黃瓜應(yīng)對根結(jié)線蟲防衛(wèi)反應(yīng)中的作用，從野生角瓜中克隆獲得CmWRKY20，CmWRKY20表達(dá)表現(xiàn)為抗病材料高于感病材料，說明CmWRKY20表達(dá)與角瓜對根結(jié)線蟲的抗性相關(guān)，且具有組織特異性；根結(jié)線蟲侵染誘導(dǎo)了角瓜CmWRKY20的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，表明CmWRKY20介導(dǎo)的抗性反應(yīng)對根結(jié)線蟲的識別調(diào)控轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；同時(shí)，SA誘導(dǎo)CmWRKY20轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)表達(dá)，MeJA則抑制其表達(dá)，這種調(diào)控模式與擬南芥AtWRKY70和番茄SlWRKY70極為相似[23，25]，推測CmWRKY20與WRKY70類轉(zhuǎn)錄因子具有相似的作用，在雙子葉植物與R基因介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中的功能具有保守性。

植物與線蟲互作進(jìn)化形成了一套多基因參與的復(fù)雜高效的防御體系[5]。擬南芥受甜菜孢囊線蟲(Heteroderaschachtii，BCN)侵染后，WRKY6下調(diào)抑制了BCN防衛(wèi)反應(yīng)，過表達(dá)WRKY6誘導(dǎo)SA信號基因NPR1進(jìn)而引起PR-1與其他防衛(wèi)基因的表達(dá)，致使BCN雌蟲數(shù)目減少，wrky11、wrky17突變體中JA合成基因AOS和LOX2的表達(dá)降低，wrky11和wrky17雙突變體增強(qiáng)了SA防衛(wèi)基因PR-1的表達(dá)，WRKY11和WRKY17通過正向調(diào)控JA合成增強(qiáng)了BCN抗性[24]。番茄Mi-1介導(dǎo)的根結(jié)線蟲抗性至少啟動了2條獨(dú)立的防衛(wèi)信號通路：依賴于SA和WRKY70以及與SA無關(guān)而依賴于WRKY72的信號通路[22-23]。這些研究說明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過SA/JA信號傳導(dǎo)參與線蟲防衛(wèi)反應(yīng)的調(diào)控。CmWRKY20是否為角瓜根結(jié)線蟲抗性所必需，CmWRKY20的調(diào)控靶標(biāo)以及CmWRKY20如何通過SA/JA 信號傳導(dǎo)調(diào)控角瓜根結(jié)線蟲抗性及其調(diào)控模式尚在進(jìn)一步研究之中。