山羊PHKG1基因克隆及其表達特性分析

李 鑫，何小芳，張 浩，鄭建瑩，王雨雪，林亞秋，王 永，朱江江

(1.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部，四川省重點實驗室，四川 成都 610041； 2.西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都 610041)

人們對肉產品的質量要求隨著生活水平的提高而越來越高，山羊肉因其低膽固醇，富含人體必需的各種氨基酸和脂肪酸等特點而深受消費者青睞[1]。肌肉pH值、肉色、系水力、肌肉嫩度等肉質性狀直接受動物體內糖原的含量影響[2]。磷酸化酶激酶(Phosphorylase kinase，PHK)參與糖原分解，是催化分解的限速酶，其活性受到Ca2+的調節，Ca2+通過其內源性鈣調蛋白亞基(δ)導致變構活化，而外源性鈣調蛋白(δ′)依賴于Ca2+的結合進一步激活。磷酸化激活糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase)將糖原降解，在肝臟中可以維持血糖，而在肌肉中維持肌肉收縮[3-4]。PHK是由α、β、γ、δ 4種亞基組成的全酶(αβγδ)4[5]，其中α、β、δ為調控亞基，γ為催化亞基(包括γ1和γ2)，γ1和γ2亞基分別由磷酸化酶激酶γ1(Phosphorylase kinase γ1，PHKG1)基因和磷酸化酶激酶γ2(Phosphorylase kinase γ2，PHKG2)基因編碼[6-7]。

研究表明，PHKG1基因在糖原分解的級聯激活中發揮調控作用[8]，通過磷酸化激活糖原磷酸化酶，從而介導糖原分解的神經和激素調節。Winchester等[4]提出PHKG1基因存在弱的多聚腺苷酸化和第 6 內含子切割位點，因此，將PHKG1的第6外顯子鑒定為3′復合末端外顯子。Camus等[9]確定PHK為激酶抑制劑化合物的靶標，且發現PHKG1在人類腫瘤樣品中上調，證實其參與血管生成和作為抗腫瘤治療的潛在靶點的價值。Ma等[8]對豬PHKG1進行深度測序，發現其第9內含子剪接受體位點發生一個點突變(C> A)，異常轉錄物導致動物體內蛋白質水平下降和酶活性減弱，且使豬肉持水量減少> 20%。Zappaterra等[10]表示PHKG1剪接突變(g.8283C>A)對大白豬的豬肉持水力呈累加效應且對肉色呈顯性影響。Liu等[11]證明杜洛克×陸川雜交豬的PSE肉是由PHKG1的剪接突變引起的，該研究結果進一步支持了PHKG1致病突變對肉質的影響。Xue等[12]發現PHKG1在雞生長發育3個階段存在差異表達，可作為雞生長差異的潛在候選基因。以上研究說明PHKG1參與機體內許多生物學過程，對動物肉質具有重要影響，但尚未見羊方面的報道。

因此，本研究以簡州大耳羊為研究對象，擬通過克隆獲得山羊PHKG1基因的序列并進行生物信息學分析，利用實時熒光定量PCR技術(Quantitative Real-time PCR，qPCR)檢測該基因在不同組織及不同分化階段脂肪細胞中的表達變化，為進一步研究該基因在脂肪沉積中發揮的生物學功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物與樣品采集 以成年(1周歲)健康簡州大耳羊為試驗動物(n=8，購自四川省簡陽市大哥大牧業有限公司)。屠宰后收集羊的心、肝、脾、腎、肺、皮下脂肪、背最長肌等組織樣品，使用DEPC水清洗樣品后迅速裝入RNase free凍存管中，置于液氮中保存。

1.1.2 試驗試劑 TRIzol、SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)試劑盒、pMD-19T Vector購自TaKaRa公司，DNA回收試劑盒、DNA聚合酶、大腸桿菌DH5α感受態細胞購自天根生化科技有限公司，反轉錄試劑盒購自Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 山羊PHKG1基因克隆 根據GenBank上山羊PHKG1基因預測序列(XM_018040602.1)，使用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物(表1)。

表1 PCR和熒光定量PCR(qPCR)引物信息Tab.1 Primers information for PCR and quantitative real-time PCR(qPCR)

PCR反應體系為：Taq酶12.5 μL，背最長肌cDNA 1 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL，反應總體系為25 μL。PCR擴增程序：預變性(94 ℃，4 min)；變性(94 ℃，30 s)，退火(58 ℃，45 s)，延伸(72 ℃，2 min)，38個循環；延伸(72 ℃，10 min)，4 ℃保溫。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，使用DNA回收試劑盒對目的片段進行回收和純化，將純化產物連接至pMD-19T載體，轉化至熱激后的DH5α感受態細胞，隨后接種到含有 Amp 的LB固體培養基上，37 ℃過夜培養，對陽性菌落進行菌落PCR鑒定后送至成都擎科生物技術有限公司測序。

1.2.2 山羊PHKG1基因生物學特性 山羊PHKG1基因生物學特性分析及方法參見表2。

表2 分析內容及相應分析工具Tab.2 Analytical contents and the corresponding analysis tools

1.2.3 山羊PHKG1基因組織表達差異分析 根據克隆獲得的PHKG1基因設計qPCR引物(表1)。利用qPCR技術檢測PHKG1在各個組織中表達的差異，TBP為內參基因以矯正基因的相對表達水平。qPCR反應體系：10 μmol/L上、下游引物各1 μL ，SYBR?Premix Ex TaqTM (2×)10 μL， cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL，總體系為20 μL，每個組織樣本設置3個重復。反應條件：預變性(95 ℃ 3 min)；變性(95 ℃ 10 s)，退火(60 ℃ 10 s)，延伸(72 ℃ 15 s)，共38個循環。

1.2.4PHKG1基因在山羊不同部位前體脂肪細胞分化過程中的表達差異分析 復蘇青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部，四川省重點實驗室前期保存的山羊肌內和皮下前體脂肪細胞，待長至F380%時進行誘導分化，分別收集不同階段(0，12，24，36，48，60，96 h)的細胞提取RNA并反轉錄成cDNA，以UXT基因為內參基因，利用qPCR檢測PHKG1基因在各個階段的表達水平。反應體系和程序與1.2.3相同。

2 結果與分析

2.1 山羊PHKG1基因的克隆

以簡州大耳羊背最長肌cDNA為模板，經PCR擴增獲得與預期目的產物大小相符的片段(圖1)，測序得到PHKG1基因片段長度1 233 bp，其中CDS區1 164 bp，無5′UTR序列，3′UTR 69 bp，共編碼387個氨基酸。

M.DL2000 DNA Marker；1.PHKG1目的條帶。M.DL2000 DNA Marker；1.PHKG1 target strip.

2.2 山羊PHKG1基因序列分析

2.2.1 氨基酸序列同源性 利用DNAMAN對不同物種PHKG1基因所編碼的氨基酸序列進行比對，顯示簡州大耳羊與綿羊(XP_027817635.1)、牛(NP_001039951.1)、豬(NP_001280073.1)、馬(XP_001493403.2)、人(AAH69655.1)的PHKG1氨基酸序列相似性依次為99%，98%，94%，96%和93%，說明該基因在不同的物種間具有較高的保守性(圖2)。

2.2.2 蛋白理化性質分析 用ExPASy在線工具對山羊PHKG1氨基酸序列進行分析，其預測蛋白分子式為C2016H3156N544O580S18，分子質量為44.87 ku；在氨基酸組成中，亮氨酸(Leu)含量為9.6%，是占比最高的氨基酸殘基；帶正電荷(Arg+Lys)和帶負電荷(Asp+Lys)的氨基酸殘基總數分別為50和51，表明山羊PHKG1蛋白可能帶負電荷；理論等電點(Protein isoelectric point，pI)為6.81，親水性總平均值為-0.330，不穩定指數為45.83，因此，預測PHKG1蛋白屬于酸性親水不穩定蛋白。磷酸化位點預測顯示，山羊PHKG1蛋白有31個磷酸化位點，其中包括絲氨酸(Ser)磷酸化位點18個，蘇氨酸(Thr)磷酸化位點10個，酪氨酸(Tyr)磷酸化位點3個。糖基化位點預測顯示，該蛋白有4個O糖基化位點，分別位于2，6，12和329位點；無N糖基化位點。山羊PHKG1蛋白沒有跨膜結構域且無信號肽；亞細胞定位表明其主要存在于細胞質(73.9%)中，其次為細胞核(13.0%)和線粒體(13.0%)。

黑色.同源性=100%；粉色.同源性>75%；藍色.同源性>50%；白色.同源性<50%。Black.Homology=100%；Pink.Homology>75%；Blue.Homology>50%；White.Homology<50%.

2.2.3 蛋白質二級結構及蛋白相互作用預測 用ExPASy預測蛋白二級結構，顯示PHKG1蛋白有138個(35.66%)氨基酸可能形成α-螺旋(Alpha helix)，167個(43.15%)氨基酸可能形成無規則卷曲(Random coil)，82個(21.19%)氨基酸可能形成延伸鏈(Extended strand)(圖3-A)。蛋白質三級結構的預測結果與二級結構預測結果基本一致(圖3-B)。相互作用分析顯示，PHKG1蛋白可能與CALM1、PHKA1、PYGM、PHKB、PHKG2、PHKA2和PYGL等蛋白存在相互作用(圖3-C)。

A.PHKG1蛋白質二級結構預測，其中藍色豎線表示α螺旋，紅色豎線表示延伸鏈，紫色豎線表示無規卷曲；B.PHKG1蛋白質三級結構預測；C.PHKG1蛋白質互作網絡。A.The second-order structure prediction of PHKG1 protein， α-hehix indicated with the blue， extended strand indicated with the red，random coil indicated with the purple；B.PHKG1 protein tertiary structure prediction；C.PHKG1 protein interaction network.

2.3 山羊PHKG1的系統進化樹分析

為了研究山羊PHKG1蛋白的進化過程，用MEGA 5.0構建進化樹。結果(圖4)顯示，山羊與綿羊首先聚為一類，親緣關系最近，因與牛同屬反芻動物聚類在同一分支，與原雞的親緣關系最遠，符合物種的進化規律。

GenBank登錄號：小鼠.NP_035209.1；大鼠.NP_113761.1；兔.NP_001095175.1；豬.NP_001280073.1；狗.XP_0222275227.1；貓.XP_023102031.1；牛.NP_001039951.1；山羊.XP_017896091.1；斑馬魚.NP_001018868.1；綿羊.XP_027817635.1；馬. XP 001493403.2；人.AAH69655.1；原雞.XP_015151218.1。

2.4 山羊PHKG1基因組織表達分析

利用qPCR方法檢測PHKG1基因在山羊各個組織中的表達水平，結果表明，PHKG1基因在所檢測的7個組織中均有表達，以背最長肌中的表達最高，極顯著高于其他的組織(P<0.01)，在皮下脂肪、腎、心、肝、肺和脾組織表達量相對較低，組織間差異不顯著(圖5)。

不同大寫字母表示數據間差異極顯著(P<0.01)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6同。

2.5山羊PHKG1基因時序表達分析

qPCR檢測PHKG1基因在山羊肌內和皮下前體脂肪細胞分化不同階段的相對表達水平。結果表明，在肌內前體脂肪細胞分化過程中該基因的相對表達水平呈上升-下降-上升-下降的趨勢，在60 h時達最高，顯著高于0 h(P<0.05)(圖6-A)；在皮下前體脂肪細胞的時序表達中，該基因的相對表達水平先維持穩定且均處于較低水平，在48～96 h相對表達量升高，96 h時表達量極顯著高于前期表達量(P<0.01)(圖6-B)。

3 討論與結論

研究發現與糖原分解有關的PHKG1基因功能喪失，導致糖原分解酶的缺乏，從而導致豬的糖原累積病(Glycogen storage disease，GSD)，而消除該基因的不良突變將大大降低GSD的發病率并改善豬肉質量[13]，因此，該基因在動物肉質研究中被引起重視。為了闡明山羊PHKG1基因特性，本研究克隆獲得包括完整CDS的PHKG1基因序列，經蛋白質相互作用預測發現，其與CALM1、PHKA1、PYGM、PHKB、PHKG2、PHKA2和PYGL等蛋白可能存在相互作用。PHK的α亞基具有調控作用，其中磷酸化酶激酶α1(Phosphorylase kinase α1，PHKA1)基因編碼肌肉組織特異表達的αM型，PHKA2基因編碼肝臟特異表達的αL型；PHKB基因編碼其β亞基；CALM1、CALM2和CALM33個基因共同編碼的δ亞基為鈣調節蛋白，可以在不同 Ca2+濃度的條件下調節酶活性[14-16]。Bali等[17]報道，由PHKA2、PHKB和PHKG2基因的突變引起的PHK缺乏是糖原貯積病(糖原貯積病Ⅸ型)最常見的原因之一。糖原磷酸化酶(PYGM)通常以去磷酸化狀態存在而不具活性，在PHK和鈣離子存在時，被磷酸化而獲得活性[18-19]。而PYGM基因缺陷可引起人類Ⅹ型糖原貯積病[20]。對PHKG1超表達后，檢測到PHKG2和磷酸甘油酸變位酶基因(PGAM2)表達量亦上調[21]。綜上所述，本試驗預測的蛋白質互作的結果輔證了PHKG1參與糖原代謝。

A.PHKG1在山羊肌內前體脂肪細胞分化過程中的相對表達量；B.PHKG1在山羊皮下前體脂肪細胞分化過程中的相對表達量。A .The relative expression of PHKG1 during the differentiation of intramuscular preadipocytes in goat；B. The relative expression of PHKG1 during the differentiation of subcutaneous preadipocytes in goat.

前人對多個物種間PHK家族基因進行了研究，結果表明，其家族成員在多種動物以及人的組織中存在廣泛表達[8，22]。為探究該基因是否在山羊各組織中廣泛表達，本試驗構建了山羊PHKG1基因組織表達圖譜，結果表明，PHKG1在山羊的心、肝、脾、腎、肺、背最長肌、皮下脂肪組織中均有表達，并且在背最長肌中相對表達量最高，其次為皮下脂肪，說明PHKG1在山羊的各組織中廣泛表達且具有組織特異性。糖原主要集中于肝臟和肌肉[23]，肌肉對維持機體運動時的血糖平衡起著重要作用[24]，運動時肌漿網釋放的鈣離子可變構激活PHK，使磷酸化酶b轉變為有活性的磷酸化酶a[25-26]。王圓圓[21]發現，PHKG1在從江香豬和大白豬背最長肌組織中的表達量最高，在脂肪中的表達量較高，在其他組織中表達水平較低，與本研究結果類似。綜合以上推測PHKG1基因在動物肌肉組織糖原代謝中發揮重要作用。同時本研究發現，PHKG1在肌內和皮下前體脂肪細胞分化過程中的表達模式有區別，可能是由于皮下脂肪位于真皮之下，肌內脂肪位于肌纖維之間，二者所處的部位和發育環境不同[27]，且皮下脂肪為儲能組織，而肌內脂肪多與肉質性狀相關[28]，屬功能性組織，另外在豬中的研究證明，不同部位脂肪沉積具有明顯的時序性和組織特異性，肌內脂肪的沉積晚于皮下脂肪[29]。本研究還發現，PHKG1基因在誘導分化后第60小時的肌內脂肪細胞和誘導分化后第96小時的皮下脂肪細胞內表達水平分別顯著和極顯著高于分化前表達水平，推測該基因可能具有促進分化的作用。隨著前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化，糖代謝水平也發生改變，細胞會攝取利用葡萄糖為維持正常生命活動提供能量，亦通過轉化作用生成甘油三酯的合成底物[30]如丙酮酸、乙酰輔酶A(CoA)和3-磷酸甘油等。因此，PHKG1基因可能通過對糖原代謝的調控而在山羊脂肪細胞分化過程起重要作用，但如果要全面深入的闡明PHKG1基因對山羊脂肪細胞分化的調控作用則需要進一步進行功能研究。

本試驗克隆得到山羊PHKG1基因CDS全長1 164 bp，編碼387個氨基酸，無跨膜結構、無信號肽且主要在細胞質中發揮作用。PHKG1基因在山羊背最長肌中表達最高，在分化后的脂肪細胞中的表達水平顯著高于未分化的前體脂肪細胞。