禽流感病毒H9N2亞型HA蛋白在水稻胚乳中的穩定、高效表達及活性鑒定

趙翔玥，張二芹，許倩茹，馬凡舒，王雅楠，牛香香，李雪洋，張申立，張同旭，鄧瑞廣，張以芳，張改平

(1.云南農業大學，云南 昆明 650201；2.河南農業大學，河南 鄭州 450046；3.河南省農業科學院 河南省動物免疫學重點實驗室 農業部動物免疫學重點開放實驗室，河南 鄭州 450002；4.西北農林科技大學，陜西 楊凌 712100；5.吉林大學，吉林 長春 130012；6.河南南陽市第四職業中等專業學校，河南 南陽 473000)

禽流感(Avian influenza，AI)是由禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)引起的一種以呼吸系統疾病為特征的傳染病，1878年首次在意大利暴發流行，當時稱之為“雞瘟”，分為高致病性和低致病性禽流感[1-3]。H9N2亞型為低致病性禽流感，感染雞群后尤其是產蛋雞群，通常引起輕度呼吸道疾病，使蛋雞產蛋率急劇下降或者與其他病原體共同感染進而出現高死亡率[4]，不僅給養雞業造成重大的經濟損失，也給人類健康生活帶來了極大隱患。哈獸研禽流感研究室在2016年對我國雞場進行的禽流感病原學調查中發現，禽流感陽性雞群中H9亞型陽性雞群占總數的37.12%，這表明了H9N2亞型禽流感在我國廣泛存在。

AIV屬于正黏病毒科A型流感病毒屬的單股負鏈RNA病毒，共編碼10種蛋白，包括結構蛋白PB1、PB2、PA、HA、NA、NP、M1、M2及非結構蛋白NS1和NS2。其中HA蛋白是AIV粒子表面最主要囊膜糖蛋白，也是AIV最重要的保護性抗原，該蛋白產生的抗體不僅可以中和病毒，還可以刺激宿主產生細胞毒性淋巴細胞反應。

目前，預防H9N2亞型AIV主要以傳統疫苗為主，即滅活苗和弱毒苗。滅活苗主要誘導機體產生體液免疫應答，不能抵抗異源毒株的感染，長期使用易導致不同亞型抗原間的重排和抗原變異，常出現免疫失敗的現象。減毒活疫苗仍存在活病毒成分，有返毒風險，而且疫苗的保存、成本、運輸條件較高。因此，隨著生物技術的發展，研究者們陸續投入新型疫苗的研發以彌補傳統疫苗的不足，如亞單位疫苗。HA是流感病毒亞單位疫苗研制的主要靶抗原，許多研究人員已在各種表達系統中表達HA蛋白，進行動物試驗，并評估HA蛋白免疫效果。李春紅等[5]、易華山等[6]分別在原核表達系統中表達HA蛋白，雖然能與抗體發生反應，但易以包涵體的形式存在，活性不高；何宏軒等[7]制備的DNA疫苗，可誘導雞群產生免疫保護，但接種的DNA有可能與宿主的基因組整合；徐一鳴等[8]將H9的HA基因在酵母中成功表達，但酵母系統表達蛋白分泌效率低，不適合高密度培養；張民秀等[9]、Lin等[10]、石霖等[11]在桿狀病毒(Baculovirus)-昆蟲細胞中成功表達了HA蛋白，且具有良好的生物學活性；陳平等[12]將HA基因插入雞痘病毒，制成的重組雞痘病毒疫苗，能明顯的抑制病毒排出；孫瑩等[13]構建HA基因重組鴨腸炎病毒，免疫鴨能誘導產生AIV HI抗體效價，可阻止80%以上免疫鴨排毒；Liu等[14]重組火雞皰疹病毒-HA，也可預防病毒攻擊。

H9N2亞型禽流感亞單位疫苗的研究不計其數，但由于這些表達系統表達出的重組蛋白存在產量較低、生產和后期純化成本較高以及存在重組蛋白的穩定性和安全性等問題，基本上都處在研究階段，限制了這些表達系統在生產中的應用[15]。有研究表明，通過水稻胚乳細胞高效表達平臺表達得到的狂犬病毒重組G蛋白、新城疫病毒重組HN蛋白和重組F蛋白具有成本較低、易于儲存、免疫活性較高的特點[16-19]。鑒于此，為了在體外得到表達量高、易儲存、易規模化、成本低且免疫活性高的禽流感H9N2亞型HA蛋白，選擇水稻胚乳細胞高效表達平臺表達HA蛋白，且通過雜交提高蛋白的表達量，旨在為新型、高效H9N2亞型禽流感亞單位疫苗的制備奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

根據GenBank的HA基因序列，重組質粒pUC57-HA由南京金斯瑞公司合成。中間載體pMP3、植物表達載體pCAMBIA1300、根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105等均由武漢禾元生物技術有限公司提供。Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)購自瑞士Roche公司；10×Loading Buffer、DL10000 DNA Marker、PremixTaq、dNTPs等均購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自美國Axygen公司；NC膜、PVDF膜均購自美國Millipore公司；潮霉素B、卡那霉素(Kan)、特美汀等均購自美國Phyto Technology公司；所有限制性內切酶均購自NEB公司；乙酰丁香酮(AS)、植物激素6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、吲哚；3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、6-糖基氨基嘌呤(KT)等均購自Biosharp公司。LB、農桿菌懸浮培養基、誘導培養基、共培養基、篩選培養基、分化培養基及生根培養基等均參照武漢禾元科技股份有限生物公司提供的方法配制。商品化桿狀病毒-昆蟲細胞表達的H9N2亞型禽流感HA蛋白和兔多抗血清等均購自北京義翹神州科技有限公司；辣根過氧化酶(Horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1HA基因序列優化及引物設計 從GenBank中獲得HA氨基酸序列，根據水稻密碼子偏愛性優化基因序列，由南京金斯瑞公司將HA基因序列合成到pUC57上，應用Primer 5.0軟件設計1對特異性引物和2對qPCR引物和1對內參(RBE4)引物(表1)。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 合成的引物Tab.1 Synthetic primer

1.2.2 中間載體和植物表達載體的構建MlyⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質粒pUC57-HA，NaeⅠ和XhoⅠ雙酶切中間載體pMP3；經膠回收、T4DNA連接酶連接轉化到大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，然后進行PCR和重組質粒酶切鑒定，最后送到公司測序鑒定HA基因序列；分別用限制性內切酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切pMP3-HA和植物載體pCAMBIA1300，切膠回收、連接轉化，并用PCR和雙酶切鑒定將重組質粒送到公司進行測序鑒定。

1.2.3HA基因的水稻遺傳轉化 通過電轉化法，將重組質粒pCAMBIA1300-pMP3-HA轉化到農桿菌EHA105中。農桿菌侵染培養8～9 d水稻愈傷組織30～40 min，其次將愈傷組織接種到共培養基上，25 ℃暗培養3 d 后用頭孢水沖洗，置于無菌濾紙上晾干后轉移至篩選培養基，26 ℃暗培養30～35 d，然后轉移到分化培養基上培養約30 d，再轉移至生根培養基中培養，待根系完全長出后，移栽至溫室煉苗。

1.2.4 轉基因水稻植株的PCR檢測 采取煉苗期間水稻植株葉片，通過CTAB法提取水稻的總DNA。PCR反應體系(25 μL)：PremixTaq2.5 μL，HA-F(0.01 mol/L)1 μL，HA-R(0.01 mol/L)1 μL，水稻總DNA 1 μL，H2O 16.5 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。最后用1%瓊脂糖凝膠核酸電泳進行鑒定。

1.2.5 T1水稻種子HA蛋白的表達鑒定 將獲得的轉基因水稻種子進行切半粒研磨成粉，按1∶5加入HA蛋白提取液(20 mmol/L Tris-HCl，25 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH值8.5)。室溫下攪拌1 h，然后12 000 r/min離心20 min，吸取上清液至新的離心管中，保存于4 ℃備用。分別用Dot Blot和Western Blot的方法檢測HA蛋白的表達。Dot Blot檢測：裁剪合適大小的NC膜，取提取好的蛋白點在NC膜上，每點1 μL，待其完全風干，經封閉、一抗孵育、二抗孵育及顯色，鑒定HA蛋白的反應活性。Western Blot檢測：取適量取提取好的蛋白，通過10% SDS-PAGE電泳，利用轉印電泳將蛋白到合適大小的PVDF膜上，經封閉、一抗孵育、二抗孵育及顯色，鑒定HA蛋白的反應活性。

1.2.6 純合子植株的篩選 利用熒光定量PCR的方法[20-21]，篩選轉HA蛋白的純合子株系。用水稻的內源基因水稻淀粉分支酶基因(Rice starch branching enzyme，RBE4)(單拷貝)作為內參，通過比較Ct(2-ΔΔCt)值進行篩選。純合子的2-ΔΔCt值為雜合子的2倍，所以依據2-ΔΔCt值來判定純合子植株。首先用qPCR篩選出引物，做出標準曲線和溶解曲線，然后用CTAB法提取T2水稻的新鮮葉片DNA，進行qPCR擴增。反應體系20 μL：DNA模板2 μL，2×SYBR Green mix 5 μL，QHA-F和QHA-R各0.5 μL。反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s，53 ℃ 20 s，35個循環；95 ℃ 15 s，53 ℃ 20 s。每個反應重復3次。

1.2.7 高表達雜交植株的篩選 利用溫湯殺雄剪穎授粉法[22]，將含有HA蛋白的TP309水稻與低谷蛋白雜交，經過T1和T2檢測和種植，最終在T3獲得純合低谷蛋白水稻，通過觀察雜交前后種子外觀發生的變化、SDS-PAGE和Western Blot檢測，判斷雜交前種子和雜交后種子HA蛋白表達量。

1.2.8 HA蛋白活性檢測 將提取的水稻源的HA蛋白和商品化的HA蛋白(桿狀病毒-昆蟲細胞表達)分別稀釋6個組，即：0.062 5，0.125 0，0.250 0，0.500 0，1.000 0，2.000 0 mg/L。通過雙抗夾心ELISA的方法對比檢測2個蛋白的活性[23]。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的鑒定與分析

MlyⅠ和XhoⅠ雙酶切pUC57-HA(圖1)及NaeⅠ和XhoⅠ雙酶切中間載體pMP3(圖2)，分別經膠回收、連接，轉化到E.coliDH5α中，經PCR和雙酶切鑒定pMP3-HA，并送到公司測序，結果正確。用Hind Ⅲ和EcoRⅠ分別酶切重組質粒pMP3-HA(圖2)和植物載體pCAMBIA1300，分別經膠回收、連接，轉化到E.coliDH5α菌中，經PCR和雙酶切鑒定pCAMBIA1300-HA(圖3)，并送到公司測序，與預期結果相符。

M. DL10000 DNA Marker；1.重組質粒pUC57-HA雙酶切產物。M. DL10000 DNA Marker；1.Recombinant plasmid pUC57-HA double digestion product.

M. DL10000 DNA Marker；1.PCR擴增產物；2.重組質粒pMP3-HA雙酶切產物。M. DL10000 DNA Marker；1.PCR amplification products；2.Recombinant plasmid pMP3-HA double digestion product.

M. DL10000 DNA Marker；1.PCR擴增產物；2.重組質粒pCAMBIA1300-HA雙酶切產物。M. DL10000 DNA Marker；1.PCR amplification products；2.Recombinant plasmid pCAMBIA1300-HA double digestion product.

2.2 HA陽性植株的篩選與分析

經農桿菌EHA105將重組質粒pCAMBIA1300導入到水稻愈傷組織中，經過暗培養、篩選、分化、生根移栽，提取葉片DNA，經PCR檢測，共檢測到66株為陽性植株(圖4)。

M. DL10000 DNA Marker；1-48，51-111.轉基因植株的檢測；49.陽性對照；50.陰性對照。M. DL10000 DNA Marker；1-48，51-111.Detection of transgenic plants；49.Positive control；50.Negative control.

2.3 HA蛋白表達鑒定與分析

取檢測為陽性的4株植株種子，研磨，加提取液，攪拌，離心，取上清，通過Dot Blot和Western Blot檢測。結果顯示，NC膜上出現特異性蛋白圓點(圖5)，PVDF膜上顯示出一條大小約為130 ku的特異性蛋白質條帶(圖6)。說明HA蛋白已在水稻胚乳中表達，且具有良好的反應原性。

1-4.水稻源重組HA蛋白。圖6同。1-4.Rice-derived recombinant HA protein.The same as Fig.6.

M.蛋白質Marker。M.Protein Marker.

2.4 T1HA純合子植株的篩選與分析

設計2對qPCR引物，利用陽性質粒篩選2對引物的特異性，確定標準曲線(圖7)和溶解曲線(圖8)，最終確定引物QHA-F2：5′-ACAAGATCACCAGCAAGGTCA-3′；QHA-R2：5′-TTGTTGATCATGTTGAGGCG-3′。應用RBE4作為內參，檢測陽性植株HA基因的Ct值，每個樣品重復3次，通過比較RBE4和HA基因的Ct值，根據公式2-ΔΔCt進行篩選純合子。純合子的2-ΔΔCt值約為雜合子的2倍，107株中篩選到31株純合子植株，部分結果如表2所示。

圖7 QHA-F2/R2引物的標準曲線Fig.7 Standard curve for QHA-F2/R2 primers

圖8 QHA-F2/R2引物的熔解曲線Fig.8 Melting curve of QHA-F2/R2 primer

表2 熒光定量PCR檢測HA的T1植株的純合子Tab.2 Detection of homozygotes T1 generation of HA by fluorogenic quantitative PCR

2.5 高表達雜交植株的鑒定與分析

利用溫湯殺雄剪穎授粉法，將含有HA蛋白的TP309水稻與低谷蛋白雜交，T1、T2經檢測后種植，在T3篩選到含HA蛋白的純合低谷蛋白水稻。通過Western Blot檢測4株雜交后HA蛋白，結果在130 ku附近出現單一且很粗的條帶(圖9)。通過外觀觀察發現，雜交前種子多數呈土黃色；雜交后種子的顏色為白色，且顆粒飽滿(圖10)。通過Western Blot檢測發現， HA蛋白表達量提高較多(圖11)。

M.蛋白質Marker；1-1，2-1，3-1，4-1.雜交后的HA蛋白。M.Protein Marker；1-1，2-1，3-1，4-1.Hybridized HA protein.

圖10 雜交前后種子外觀變化Fig.10 Seeds appearance changes before and after hybridization

M.蛋白質Marker；1.陰性對照；2.雜交前HA蛋白；3.雜交后HA蛋白。M.Protein Marker；1.Negative control；2.HA protein before hybridization；3.HA protein after hybridization.

2.6 HA蛋白ELISA檢測分析

將水稻源HA蛋白和商品化桿狀病毒-昆蟲細胞表達的HA蛋白分別稀釋6組，即0.062 5，0.125 0，0.250 0，0.500 0，1.000 0，2.000 0 mg/L。通過雙抗夾心ELISA法檢測2個蛋白的活性。結果表明，水稻源重組HA蛋白活性高于昆蟲源重組HA蛋白(圖12)。

圖12 ELISA方法檢測水稻源和昆蟲源HA蛋白活性Fig.12 Detection activity of HA protein from rice and insect respectively by ELISA

3 結論與討論

植物表達系統表達重組蛋白在生產成本、規模化和產品安全方面具有優勢，與所有的生物反應器相比，植物是最廉價的“工廠”[24]。而水稻作為嚴格的自花授粉植物，很好地避免了田間污染的問題。水稻本身使用廣泛、過敏性低，這一點不同于煙草，且已經被FDA公證過，對動物體沒有任何的傷害；不攜帶任何的動物源性疾病，用水稻胚乳作為反應器更安全[25]。水稻作為單子葉真核植物，細胞內可以進行完整的蛋白修飾和加工，這也有利于對目的蛋白進行設計轉入后的復制和擴增，可以很好地提高目的蛋白的表達量[26]。

HA蛋白是AIV疫苗研制的主要靶抗原，所以本研究選擇HA基因作為靶基因，利用水稻胚乳表達系統表達H9N2亞型HA蛋白。將優化的HA基因成功構建到植物載體pCAMBIA1300上，使pCAMBIA1300-HA植物表達載體上不僅含有中間載體pMP3上利于外源基因在水稻中表達的GT13特有啟動子、信號肽SP和終止子，還能夠通過根癌農桿菌成功地將HA基因轉入水稻的愈傷組織中。愈傷組織經過篩選、分化、生根和田間種植，經PCR結果顯示，T0有66株水稻的HA基因已經整合到水稻基因組上。通過Dot Blot和Western Blot方法檢測T0水稻種子，HA基因已在水稻胚乳中的成功表達。為了確保HA蛋白在水稻中能夠穩定遺傳，利用qPCR篩選了107株T1成功表達HA的株系，獲得了31株穩定遺傳的HA蛋白水稻株系；為了提高HA蛋白在水稻胚乳中的表達量，采用溫湯殺雄剪穎授粉法，將含有HA蛋白的TP309水稻與低谷蛋白水稻雜交，經過3代種植篩選后，用SDS-PAGE和Western Blot方法檢測T3雜交種子，獲得了HA表達量更高的雜交后水稻種子。利用夾心ELISA法比較水稻源和昆蟲源HA蛋白的活性，結果表明，在水稻胚乳中表達的HA蛋白活性高于桿狀病毒-昆蟲細胞。

Qiu等[27]用致死小鼠的H9N2亞型AIV毒株表達的HA和NA基因的核酸疫苗免疫小鼠；Pushko等[28]將擴增的H9N2亞型AIV的HA、NA和M1基因，獲得大量表達的HA﹑NA和M1蛋白，并自動組裝成病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒具有AIV的HA和NA活性，能有效阻止AIV在上呼吸道和肺部的復制，但是后續研究沒有與實際應用直接相連，只是處于研究階段。雖然本研究利用水稻胚乳表達系統得到的HA蛋白純化的條件還需進一步摸索，以及動物試驗還未開展，但已經在體外獲得表達量高、儲存容易、成本低、免疫活性高、安全性好、易規模化、生產工藝簡單且綠色環保的禽流感H9N2亞型的HA蛋白。本研究為后續進行蛋白質純化和動物試驗提供了依據，也為后期新型H9N2亞型禽流感亞單位疫苗的研發提供了可能。