HBV-ACLF患者肝臟B7-H6的表達水平與肝損傷的相關性

袁青?楊小安?蘭天云?鄒勇

【摘要】目的 探討HBV相關慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）患者肝組織自然殺傷細胞天然細胞毒性受體NKp30特異性配體B7同源物6（B7-H6）的表達水平與肝損傷的相關性。方法 收集HBV-ACLF患者肝移植術中切除的肝組織（HBV-ACLF組）及CHB患者（CHB組）肝穿刺標本各18例，并以5例來源于肝臟血管瘤切除標本旁的正常肝組織為正常對照組。利用免疫組織化學染色檢測3組肝組織中B7-H6的表達水平。分析肝組織B7-H6表達水平及與肝損傷程度（總膽紅素水平）的相關性。結果 B7-H6主要表達在肝細胞，而且多在肝小炎癥反應強烈區域內。定量分析顯示，HBV-ACLF組肝組織B7-H6表達的平均相對密度（127.02±40.25）高于輕度CHB組（22.08±10.82）和正常對照組（14.26±5.67）（P均< 0.05），輕度CHB組與正常對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。HBV-ACLF患者肝臟B7-H6水平與血清總膽紅素水平呈正相關（rs = 0.604，P < 0.05）。結論 肝臟B7-H6高表達可能是NKp30/B7-H6被激活導致HBV-ACLF免疫性肝損傷加劇，肝細胞大量凋亡和壞死的重要因素。

【關鍵詞】乙型肝炎病毒;肝衰竭;自然殺傷細胞;B7同源物6

Correlation between the expression level of hepatic B7-H6 and liver injury in HBV-ACLF patients

Yuan Qing， Yang Xiaoan， Lan Tianyun， Zou Yong. Department of Blood Transfusion， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Zou Yong， E-mail： zouyong0205@ 163. com

【Abstract】Objective To investigate the correlation between the expression level of hepatic B7 homologue 6 （B7-H6） and liver injury in patients with hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure （HBV-ACLF）. Method Needle biopsy liver tissues and resected liver tissue samples during liver transplantation were obtained from patients with mild chronic hepatitis B （CHB） and HBV-ACLF patients， respectively. Normal liver tissues from 5 cases of hemangioma were utilized as normal controls. The expression levels of hepatic B7-H6 were quantitatively measured by immunohistochemical staining. The correlation between the expression of B7-H6 and the degree of liver injury （total bilirubin level） was analyzed. Results B7-H6 was mainly expressed in liver cells， especially in the area with intense hepatic inflammatory responses. Quantitative analysis demonstrated that the average relative density of B7-H6 expression in the HBV-ACLF group was （127.02±40.25）/lpf， significantly higher compared with （22.08±10.82）/lpf and （14.26±5.67）/lpf in the mild CHB and normal control groups （both P < 0.05）. No statistical significance was noted between the mild CHB and normal control groups （P > 0.05）. In the HBV-ACLF patients， the B7-H6 expression level was positively correlated with the serum total bilirubin level （rs = 0.604， P < 0.05）. Conclusion High expression of hepatic B7-H6 is probably a critical factor leading to aggravation of immunity-mediated liver injury induced by NKp30/B7-H6 activation， the apoptosis and necrosis of a large quantity of liver cells in HBV-ACLF patients.

【Key words】Hepatitis B virus;Liver failure;Natural killer cell;B7 homologue 6

HBV相關慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）是終末期肝病的常見模式，在慢性乙型肝炎（CHB）或HBV相關性肝硬化患者中經常發生。HBV-ACLF是在CHB基礎上出現的急性或亞急性肝功能失代償， 臨床表現為黃疸和凝血障礙、失代償性腹水、 伴或不伴有肝性腦病[1-2]。其病情嚴重且發展迅速，病死率可高達45% ～ 90%，目前以肝移植為主要治療手段，但是絕大部分患者預后不良。目前認為，HBV-ACLF的發病是病毒和宿主雙方共同作用的結果，其中細胞免疫介導的肝細胞損傷在HBV-ACLF的發病中發揮著關鍵作用。因此，深入研究HBV-ACLF細胞介導的肝損傷機制對降低肝衰竭患者的病死率及改善預后有著重要意義。筆者前期在HBV-ACLF的研究已經證實，NK細胞在HBV-ACLF患者肝臟大量募集，外周血NK細胞表面天然細胞毒性受體（NCR）NKp30和NKp46表達增強，肝臟NK細胞pKP30的表達亦增強，提示HBV-ACLF肝細胞的大量壞死與肝臟NK細胞的過度激活以及NCR的應激表達密切相關[3]。本研究通過檢測HBV-ACLF患者肝組織NKp30特異性配體B7同源物6（B7-H6）的表達水平，探討B7-H6的應激表達與肝細胞損傷的相關性，為闡明HBV-ACLF的發病機制及尋找新的分子靶點提供理論依據。

材料與方法

一、標本來源及分組

收集2013年1月至2015年6月在我院肝移植手術切除的HBV-ACLF肝組織標本及行肝穿刺活組織檢查（活檢）確認為輕度慢性乙型肝炎（CHB）的肝組織標本。納入標準：HBV-ACLF患者須符合《肝衰竭診治指南（2012年版）》的HBV-ACLF診斷標準，CHB患者須符合《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》相關診斷標準。排除合并其他肝炎病毒或HIV、酒精性肝炎、藥物性肝病、脂肪性肝病、自身免疫性疾病者。共收集了18例輕度CHB肝組織（輕度CHB組）、18例HBV-ACLF肝組織（HBV-ACLF組），并以5例來源于肝臟血管瘤切除標本旁的正常肝組織為正常對照組。本研究方案已獲得中山大學附屬第三醫院倫理委員會的批準，患者均已簽署知情同意書。

二、主要儀器與試劑

使用日本日立7170A型全自動生化分析儀進行檢測。主要試劑包括兔抗人B7-H6多克隆抗體（Abcam，美國）、辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔二抗（Kyoto，日本）、二氨基聯苯氨（DAB）工作液（Kyoto，日本）。

三、研究方法

1. 臨床資料的收集

記錄標本來源患者的性別、年齡，肝穿刺或肝移植手術前各項生化指標如ALT、AST、總膽紅素、凝血酶原時間、凝血酶原活動度和HBV DNA水平等。

2. 免疫組織化學染色（免疫組化）

將5 μm石蠟切片脫蠟至水后用pH 6.0的0.01 mmo/L枸櫞酸鈉緩沖液進行抗原修復。用0.03%過氧化氫/硝酸鈉處理阻斷內源性過氧化物酶，10%正常兔血清室溫覆蓋組織30 min以阻止非特異性染色。滴加50 μl （1∶50） 兔抗人B7-H6多克隆抗體于切片上，37℃濕盒孵育1 h。Tris-HCl緩沖液沖洗后，加入50 ～ 100 μl HRP標記羊抗兔二抗孵育30 min，再加入DAB工作液，鏡下觀察顯色情況，蒸餾水沖洗終止顯色。利用Image-Pro Plus 7.0對肝臟B7-H6表達進行半定量分析。每張免疫組化切片隨機選取6個200倍視野，以每個視野陽性區域的光密度總和除以陽性區域的面積總和得出表達的平均相對密度值。

四、統計學處理

利用SPSS 21.0進行統計學分析。非正態分布的計量資料采用中位數（下四分位數，上四分位數）表示;正態分布的計量資料以表示，組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料用例（%）或相對比表示。肝組織B7-H6與血清總膽紅素、ALT、AST及HBV DNA的關系采用Spearman秩相關分析。P < 0.05為差異具有統計學意義。

結果

一、輕度CHB組、HBV-ACLF組和正常對照組的一般資料

3組標本來源患者的一般資料見表1。

二、輕度CHB組、HBV-ACLF組和正常對照組肝組織B7-H6的表達比較

B7-H6主要表達在肝細胞，而且多在肝小炎癥反應強烈區域內。定量分析顯示，3組肝組織B7-H6表達的平均相對密度差異有統計學意義（F = 73.731，P < 0.001）。HBV-ACLF組肝組織B7-H6表達的平均相對密度（127.02±40.25）高于輕度CHB組（22.08±10.82）和正常對照組（14.26±5.67）（P均< 0.05），輕度CHB組與正常對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖1。

三、肝組織B7-H6的表達水平與肝損傷的相關性分析

HBV-ACLF患者肝組織B7-H6表達水平與血清總膽紅素水平呈正相關（rs = 0.604，P = 0.008），B7-H6的表達水平與血清ALT、AST及HBV DNA水平均無關（P均> 0.05）。

討論

NCR包括NKp30、NKp44、NKp46，是近年發現的一類非MHV限制的特異性啟動NK細胞活化的新穎活化受體。NCR在NK細胞殺傷包括神經母細胞瘤、黑色素瘤、白血病等多種腫瘤細胞以及流感病毒、副流感病毒、EB病毒等多種病毒感染細胞中發揮著關鍵作用。現有研究表明，NCR在抗HBV及 HCV感染、肝癌中發揮著重要作用。在慢性HCV感染中，NK細胞表面NCR NKp46和NKp30表達下調，這可能是NK細胞效應功能被抑制，病毒持續感染的重要機制[4]。聚乙二醇干擾素α-2b治療CHB，對IFN產生應答的CHB患者NK細胞NKp30的表達增強，其與HBV載量降低有關，研究表明NKp30在NK細胞抗HBV感染中發揮著重要作用[5-6]。一項最新的研究表明，肝癌患者腫瘤浸潤NK細胞NKp30的表達及其配體B7-H6在肝癌組織的表達與肝癌的發生發展密切相關[7]。

NCR需要與腫瘤細胞或病毒感染細胞上特異性配體識別后才能發揮效應功能，然而尋找NCR配體的研究進展緩慢，直至2009年，美國Levin等才證實，B7家族免疫受體成員B7-H6是NK細胞活化受體NKp30的配體。B7-H6在正常人體組織中不表達，但在一些腫瘤細胞中表達上調[8]。近年進一步的研究表明，B7-H6或可溶性B7-H6在某些體外或體內炎癥條件下可被誘導表達[9]。為探討在HBV-ACLF高度炎癥狀態下肝臟B7-H6能否被應激誘導以及NKp30/B7-H6信號通路在HBV-ACLF免疫介導肝細胞損傷中的作用，本研究收集HBV-ACLF患者肝移植手術切除的肝組織及CHB患者肝穿刺標本并通過免疫組化對肝組織B7-H6的表達進行了檢測和比較。結果顯示，與CHB患者相比，HBV-ACLF患者肝組織B7-H6表達上調，而且與肝細胞損傷程度（總膽紅素水平）呈正相關，表明NKp30/B7-H6相互作用在活化NK細胞介導肝細胞損傷中可能發揮著重要作用。

綜上所述，B7-H6在HBV-ACLF患者肝組織中表達上調，其應激表達與HBV-ACLF患者肝細胞損傷的嚴重程度呈正相關，這將為深入研究HBV-ACLF肝損傷機制提供新的分子靶點和思路。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-04-21）

（本文編輯：林燕薇）