貝萊斯芽孢桿菌CY30菌株的常壓室溫等離子體誘變育種研究

劉芳 廖先清 周榮華

摘要：采用常壓室溫等離子體誘變貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）CY30菌株。菌株的致死率強度結果表明，在電源功率為100 W，處理距離2 mm，工作氣流量10 L/min時，等離子體對CY30菌株誘變最優處理時間為50 s。通過顯微鏡檢初篩誘變菌株，并利用搖瓶發酵結合芽孢數測定和殺菌活性評價進行復篩，建立完整的誘變篩選體系。通過斜面鏡檢初篩、搖瓶三輪復篩，獲得搖瓶液芽孢數122.3億/mL，殺菌活性75.58%，且遺傳穩定的突變菌株CY30-314。突變株發酵水平較出發菌株芽孢數提高25.3%，殺菌活性提高15.6%，發酵周期縮短了2 h。

關鍵詞：常壓室溫等離子（ARTP）;貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）;芽孢數;殺菌活性

中圖分類號：TQ920.1 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）10-0077-04

Abstract： Atmospheric and room temperature plasma（ARTP） was used to mutate Bacillus velezensis CY30 for improving the production of spores and fungicidal activity. The most optimal condition for the ARTP mutagenesis was working flow rate at 10 L/min， treating distance of 2 mm and electrical power of 100 W . The mutants were selected based on microscopic morphology of the colonies， the spore counts and antifungal activity of the cultures from shake-flask fermentation. A mutant with code of CY30-314 was obtained through 3 rounds of microscopic checking of the slants and shake-flask fermentation. The spore counts of the mutant in shake-flask fermentation was 12.23 billion spores/mL， and the corresponding cultures inhibited the growth of fungus for 75.58%. The mutant also showed genetic stability. The mutant produced 25.3% more spores in shake-flask fermentation which resulted in the increase of antifungal activity at 15.6%. The duration of the mutant was shorted for 2 h.

Key words： Atmospheric and room temperature plasma（ARTP）; Bacillus velezensis; spore count; antifungal activity

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）最早由Ruiz-Garcia等[1]從采自西班牙貝萊斯河的水樣中分離，可產生表面活性劑。有研究表明，不同環境中分離到的貝萊斯芽孢桿菌具有較為廣譜的抗菌活性，可抑制多種植物病原真菌、部分植物病原細菌，如抑制黃單胞菌及馬鈴薯瘡痂病菌等生長[2，3]。前期研究表明，從茶樹根際土壤中分離到貝萊斯芽孢桿菌CY30菌株，其對多種植物病原真菌具有較強的抑菌活性，并對茶輪斑病具有一定的防效[4]。

為了推動CY30菌株的產業化，對該菌株的發酵培養基進行優化，發現該菌株在發酵過程中芽孢形成不整齊，不同批次的發酵差異大。為了滿足后續工業化生產的需要， 有必要對野生菌株進行菌種選育。常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma， ARTP）技術是新興的一種誘變技術，因其具有基因損傷強度高、突變范圍廣、處理條件溫和、安全無輻射、操作便捷等優點[5]，被廣泛應用于不同微生物的誘變。廖先清等[6]利用該菌株進行了蘇云金芽孢桿菌的誘變育種，取得了較好的效果。本研究中，利用常壓室溫等離子體誘變技術對CY30菌株進行誘變育種，探索最佳誘變條件，以期獲得最佳突變株，提高該菌的產孢水平及抗菌活性，縮短發酵周期。現將試驗結果報道如下。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌株 ?貝萊斯芽孢桿菌CY30菌株由湖北省生物農藥工程研究中心從湖北恩施鶴峰縣茶園根際土壤分離得到，并保存于武漢大學中國典型培養物保藏中心，菌種保藏編號為CCTCC M2018710。

1.1.2 ?供試病原菌 ?茶擬盤多毛孢（Pestalotiopsis spp.）病原真菌由湖北省生物農藥工程研究中心分離保存。

1.1.3 ?培養基 ?①PDA培養基：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加無菌水煮沸30 min，紗布過濾，定容1 L，再加20 g葡萄糖和20 g瓊脂，煮沸，121 ℃滅菌20 min;②LB斜面培養基：胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，酵母提取物5 g，瓊脂粉20 g，無菌水1 L，pH 7.0;③LB液體培養基：胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，酵母提取物5 g，無菌水1 L，pH 7.0，500 mL三角瓶裝液量為100 mL;④發酵培養基：紅薯粉37.35 g，花生粕15.00 g，酵母膏15.29 g，工業蛋白胨15.00 g，碳酸鈣1.00 g，硫酸鎂0.30 g，磷酸二氫鉀0.10 g，無菌水1 L，滅菌前pH調至7.5，500 mL三角瓶裝液量為50 mL。

1.1.4 ?試劑與儀器 ?常壓室溫等離子體誘變機，無錫源清天木生物科技有限公司;恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司;搖床，上海智城分析儀器制造有限公司;721可見分光光度計，上海儀電科學儀器股份有限公司;超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司;顯微鏡，奧林巴斯。

1.2 ?菌株的ARTP誘變

1.2.1 ?芽孢懸浮液的制備 ?將保藏于砂土管的貝萊斯芽孢桿菌CY30菌種直接轉接于LB茄形瓶斜面培養基上進行復壯，置于30 ℃恒溫培養箱中培養96 h，挑一環菌苔轉接于LB液體培養基中，220 r/min，30 ℃振蕩培養至芽孢全部形成。無菌水稀釋至一定濃度，分光光度計測定OD600 nm在0.3～0.5，作為誘變母液。

1.2.2 ?菌株的ARTP誘變 ?在超凈工作臺中用移液槍移取10 μL芽孢懸浮液，均勻涂抹在直徑為6 mm的無菌金屬墊片上，將其置于無菌平皿內并移至預熱20 min的ARTP誘變機中，電源功率為100 W，處理距離2 mm，工作氣流量10 L/min，以氦氣為工作氣體，以處理時間為誘變的主要操作參數，誘變時間設置為20、40、60、80、100、120 s。誘變處理完成后取出金屬墊片，放入裝有1 mL無菌水的EP管中，渦旋振蕩1 min。取經振蕩的菌液稀釋至適當濃度涂平板，放入30 ℃恒溫培養箱中培養48 h 。經上述條件培養后，計數各平板上單菌落個數，取3次平均值，繪制出致死率曲線。

1.2.3 ?ARTP誘變致死率的計算 ?致死率=（A-B）/A×100%，其中，A為誘變處理前芽孢液的濃度;B為誘變處理后芽孢液的濃度。

1.3 ?誘變菌株的篩選

整體篩選流程如下：

單菌落轉接試管斜面→涂片鏡檢→搖瓶發酵→涂片鏡檢→搖瓶發酵液芽孢數測定和殺菌活性評價→制砂管保存→轉接斜面→涂片鏡檢→搖瓶復篩→搖瓶發酵液芽孢數測定和殺菌活性評價→傳代保種。

1.3.1 ?斜面鏡檢初篩 ?將經ARTP誘變處理后在LB平板上長勢均一的單菌落用接種環挑起接種在LB試管斜面上，于30 ℃恒溫培養96 h，劃線涂片，進行顯微鏡檢。

1.3.2 ?搖瓶篩選 ?將斜面鏡檢芽孢形成率高、營養體少的菌株接種一環于發酵培養基中，30 ℃ 220 r/min振蕩培養，涂片鏡檢，芽孢脫落20%下搖床。

1.3.3 ?搖瓶發酵液芽孢數測定和殺菌活性評價 ?挑搖瓶發酵鏡檢芽孢形成率高于90%、菌體整齊、生長速度快的進行發酵液芽孢數測定和殺菌活性評價。

1.3.4 ?砂土管保存 ?挑取搖瓶發酵液芽孢數測定和殺菌活性評價均高于出發菌株10%以上的菌株，刮下芽孢放入已滅菌并經無菌檢查的砂土管中，用接種環打散混勻，置于干燥器中保存。

1.4 ?搖瓶發酵液芽孢數測定和殺菌活性評價

1.4.1 ?芽孢數測定 ?采用稀釋涂布平板計數法測定，稀釋液涂布LB平板前置于80 ℃水浴20 min。

1.4.2 ?抑菌活性測定

1）拮抗菌發酵液。接種一環菌苔于發酵培養基中，30 ℃ 220 r/min振蕩培養至芽孢脫落20%時下搖床。

2）無菌濾液。取發酵液，4 ?℃10 000 r/min離心10 min，棄沉淀，得上清液后用0.22 μm微孔濾膜過濾3次得無菌濾液。

3）病原菌菌餅。將茶擬盤多毛孢接種到PDA平板上，25 ℃恒溫培養，當菌絲覆蓋培養皿1/4至1/3時，用打孔器打孔4 mm菌餅待用。

4）抑菌活性的測定。4 mm菌餅背面朝上置于PDA平板中央，在菌餅兩側約30 mm處放置滅菌濾紙片，在紙片上接種7 μL無菌濾液，以不接CY30作為對照，試驗共設置3次重復。28 ℃培養5 d測量對照和處理的菌落直徑并計算抑菌率。

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.5 ?突變株遺傳穩定性分析

在斜面培養基上活化篩選得到高活性菌株，培養96 h，連續在斜面上轉接5次，進行搖瓶發酵，分別進行顯微鏡檢芽孢形成率、發酵液芽孢數測定、殺菌活性測定，比較突變株的穩定性。

2 ?結果與分析

2.1 ?ARTP誘變時間的選擇

ARTP不同誘變時間下貝萊斯芽孢桿菌CY30菌株的致死率曲線如圖1所示。從圖1可以看出，隨著誘變時間的增加，菌體的存活率逐漸降低。40 s后致死率大幅度上升，這說明貝萊斯芽孢桿菌CY30菌株對ARTP較敏感，產生的致突變能力較大，處理60 s后致死率已經大于90%，當處理時間為100和120 s時，致死率接近100%。

2.2 ?高產突變株的篩選

2.2.1 ?斜面初篩 ?將ARTP誘變50 s并經5次單菌落分離得到的1 214株斜面菌株進行涂片鏡檢，斜面鏡檢孢囊形成率高、營養體少、菌體整齊的菌株，共得到118株優勢菌株進行下一輪搖瓶發酵。5次鏡檢初篩優勢菌株比例在10%左右，鏡檢情況如表1所示。

2.2.2 ?搖瓶篩選 ?將斜面鏡檢初篩得到的118株優勢菌株進行搖瓶發酵，并以出發菌株作為對照。得到18株發酵芽孢形成率高于95%、菌體整齊、形態好的突變株，分別進行搖瓶發酵液芽孢數測定和殺菌活性評價，3次重復取平均值。結果如表2所示，采用芽孢數測定和殺菌活性評價雙指標進行高活性突變菌株的判定，均高于出發菌株10%的菌株有8株，分別是CY30-301、CY30-304、CY30-306、CY30-309、CY30-311、CY30-314、CY30-316、CY30-318。

2.3 ?高活性突變株的搖瓶復篩

將搖瓶篩選得到的8株高活性突變株重新進行搖瓶發酵，并以出發菌株作為對照。進行顯微鏡檢，芽孢脫落20%停止培養，進行搖瓶發酵液芽孢數測定和殺菌活性評價，3次重復取平均值。由表3可知，CY30-314綜合搖瓶發酵芽孢形成率、發酵周期、芽孢數和殺菌活性等各種指標整體優于其他菌株，發酵水平較出發菌株而言，芽孢數提高25.3%，殺菌活性提高15.6%，發酵周期縮短2 h。

2.4 ?高活性突變株的遺傳穩定性

為了檢測突變株的遺傳穩定性，對高產突變株CY30-314在試管斜面上連續轉接5代，進行顯微鏡檢，搖瓶發酵培養，并進行搖瓶發酵液芽孢數測定和殺菌活性評價，3次重復取平均值，結果（表4）表明，隨傳代次數的增加，菌株的生物活性等各項性能無明顯變化，直至經5次傳代后也較為穩定。ARTP誘變產生的突變株CY30-314具有良好的遺傳穩定性，可作為工業生產菌株。

3 ?討論

分離于自然界的野生芽孢桿菌多存在發酵不穩定、產孢不整齊等特性，其工業化生產必然要對野生型菌株進行選育。菌種選育涉及自然隨機篩選與誘變篩選。采用自然隨機篩選時，由于自然突變率極低，正突變的頻率更低，通常研究者較少采用，多用于菌種的復壯或純化。而誘變篩選中，應用較為廣泛的包括紫外線輻照（UV）、亞硝基胍（NTG）、Co60γ射線輻照或物理化學誘變的結合[7]，但這些誘變方法都存在這樣或那樣的缺點。ARTP誘變育種技術操作簡便，并被應用于多種微生物的育種。本研究中，利用ARTP對CY30進行誘變育種，達到了預期的目的，證明了所建立的誘變篩選體系是高效、可行的。該方法也為其他芽孢桿菌的菌種選育提供了借鑒。本研究除提高了貝萊斯芽孢桿菌的發酵水平及抑菌活性外，還縮短了該菌株的發酵周期，可望在工業化大規模生產中顯著降低生產成本。

參考文獻：

[1] RUIZ-GARCIA C，B？魪JAR V，MATINEZ-CHECA F，et al. Bacillus velezensis sp. nov.，a surfactant-producing bacterium isolated from the river Velez in Malaga，southern Spain[J].Intl J Syst Evol Microbiol，2005，55：191-195.

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[6] 廖先清，周榮華，劉 ?芳，等.常壓室溫等離子體（ARTP）誘變快速選育對亞洲玉米螟高毒的蘇云金芽孢桿菌突變株[J].湖北農業科學，2018，57（21）：123-126.

[7] 李榮杰.微生物誘變育種方法研究進展[J].河北農業科學，2009， 13（10）：73-76，78.