棉酚致蛋雞肝臟脂沉積機制研究

王倩倩 秦衛紅 陳大偉

摘要：旨在探討游離棉酚引起的蛋雞肝臟脂質過氧化與脂肪沉積的關系，試驗將360只42周齡京粉2號商品代蛋雞隨機分為4組，對照組（C組）飼喂基礎飼糧，3個試驗組分別在基礎日糧中添加醋酸棉酚100 mg/kg（L組）、200 mg/kg（M組）、400 mg/kg（H組），喂飼42 d后，測定血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHOL）、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量，屠宰后測定肝臟脂肪酸含量和脂質過氧化指標，制備病理切片和超薄切片。結果表明，醋酸棉酚導致血清中AST、ALT升高，呈現時間與劑量效應。試驗第4周、第6周時，M、H組血清中TG和LDL-C極顯著升高（P<0.01），H組血清中CHOL和HDL-C顯著升高（P<0.05）;病理切片觀察發現棉酚導致蛋雞肝臟脂肪變性，并且呈一定的劑量效應。在肝臟脂肪酸中，醋酸棉酚使不飽和脂肪酸組成降低，飽和脂肪酸比例升高。試驗組肝臟SOD、GSH-Px活性、GSH含量顯著降低（P<0.05），MDA顯著升高（P<0.05）。超微結構觀察發現棉酚對蛋雞肝臟細胞線粒體結構造成損傷。

關鍵詞：醋酸棉酚;蛋雞;肝臟;脂肪酸

中圖分類號：F592.99 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）10-0116-004

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.10.027 ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： This research was conducted to investigate the effects of free gossypol on fatty acid in liver， lipid peroxidation index and serum index of laying hens. A total of 360 healthy 42-week-old Beijing pink 2 laying hens were randomly divided into 4 groups with 3 replicates per group and 30 hens per replicates. Laying hens in 4 groups fed the basal diet supplemented with gossypol acetate 100 mg/kg （group L）， 200 mg/kg （group M）， 400 mg/kg （group H） and 0 mg/kg （group C）. The experiment lasted for 42 days. TG， CHOL， AST， ALT， LDL-C and HDL-C were determined with biochemical analyzer. At the end of the test， laying hens were executed with bleeding， the livers were collected to determine the fatty acids and lipid peroxidation， also pathological and ultrastructure observation. The results showed that the activity of AST， ALT increased with exposed to Gossypol acetate， showing the time and dose effect. At the 4th and 6th week， TG and LDL-C have increased very significantly （P<0.01）， TC and HDL-C also increased significantly（P<0.05）. Gossypol acetate decreased the unsaturated fatty acid composition and increased the saturated fatty acid proportion in liver. Liver lipid peroxidation index SOD， GSH-Px and GSH decreased significantly（P<0.05） and MDA increased significantly（P<0.05）. Gossypol acetate caused laying hens hepatic steatosis， and showed a dose effect. Gossypol acetate caused structural damage of mitochondria in liver of laying hens. In conclusion， gossypol acetate caused the oxidative stress damage in hepatocyte， further caused the structure and function damage of mitochondrial which played an important role in fat depositing in liver of laying hens.

Key words： gossypol acetate;laying hens;liver;fatty acid

棉酚又稱棉子醇、棉毒素，是一種黃色多酚類物質，多以雙醛式存在于錦葵科植物的器官中[1]。中國棉子粕資源豐富，2014年棉花產量為618萬t[2]， 棉子粕產量可達500萬t。但由于游離棉酚、環丙烯脂肪等抗營養因子的存在大大限制了棉子粕的使用。艾曉杰[3]研究發現， 日糧中游離棉酚含量高于100 mg/kg時，可抑制成熟的卵泡分泌雌二醇和孕酮，造成卵巢萎縮，嚴重者喪失繁殖能力。蛋雞棉酚中毒時，會出現食欲減退，日漸消瘦四肢無力，嚴重者會抽搐，腹瀉，呼吸困難，冠髯發紺甚至死亡[4]。

游離棉酚在動物體內排泄緩慢，在體內組織器官中具有蓄積效應，且最主要的蓄積器官是肝臟[5]。脂肪酸的β-氧化是體內脂肪酸分解的主要途徑，供應體內所需的大量能量[6]。任何因素引起的細胞線粒體功能損傷都會造成其氧化功能下降，致使甘油三酯增多，導致肝臟脂肪變性[7]。焦洪超等[8]研究發現棉酚急性毒性中毒會引起血漿中ALT、AST水平顯著升高，血液中TG顯著降低。研究發現，140 mg/kg游離棉酚會引起海賽克斯蛋雛雞貧血，并對維持肝臟正常的生理功能有不利影響[9]。游離棉酚引起的肝臟功能紊亂與氧化應激和脂肪沉積的關系尚不明確。

本研究以京粉2號商品代蛋雞作為試驗對象，在基礎飼料中添加醋酸棉酚，研究其對蛋雞肝臟脂質過氧化、脂肪酸組成和血清生化指標的影響，觀察肝細胞的病理及超微結構的變化，探討游離棉酚對蛋雞肝臟脂肪代謝的影響及原因，為棉子粕在蛋雞飼料中的合理應用提供理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗動物

42周齡京粉2號商品代蛋雞，由農業農村部家禽品質監督檢驗測試中心（揚州）家禽生產性能測定站提供。

1.2 ?試驗設計及基礎日糧

將360只42周齡京粉2號商品代蛋雞隨機分為4組，每組設3個重復，每個重復30羽。對照組、低劑量組（L組）在基礎日糧中添加醋酸棉酚100 mg/kg，中劑量組（M組）添加醋酸棉酚200 mg/kg，高劑量組（H組）添加醋酸棉酚400 mg/kg。試驗基礎日糧組成及營養水平見表1。采用3層全階梯籠養，每個重復單獨給料，自由采食飲水，日常管理與免疫程序按常規進行，試驗周期為6周。分別于試驗第2周、第4周、第6周時，每個重復隨機抽取10只雞翅靜脈采血5 mL，分離血清備測。試驗周期結束時，每組隨機抽取10只雞屠宰，采集肝臟，部分制作切片，剩余制備成勻漿后-80 ℃保存待測。

1.3 ?測定指標及方法

1.3.1 ?血清指標的測定 ?使用全自動血清生化測定儀，測定血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHOL）、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的含量。

1.3.2 ?肝臟脂質過氧化指標的測定 ? 按照南京建成生物工程研究所提供的方法，將肝臟組織制作成10%的勻漿液，檢測相關酶的活性。

1.3.3 ?病理組織切片觀察 ? 取新鮮肝臟組織，固定于4%甲醛溶液中，每隔24 h更換1次甲醛溶液，更換2次，樣本可長期保存。常規制作肝臟組織切片，HE染色觀察并拍照。

1.3.4 ?肝臟超微結構觀察 ? 迅速采集剛處死蛋雞的肝臟組織（切成約1 mm3小塊）， 用新鮮配制的25 g/L戊二醛溶液固定后，常規制備超薄切片，在JEM-100CXⅡ型透射電鏡（Philips公司）下觀察并拍照記錄。

1.4 ?數據統計

試驗數據均以“平均值±標準誤”表示，采用SPSS 17.0單因子方差分析數據，各處理間的平均值比較采用LSD及Duncans多重比較進行差異顯著性檢驗。

2 ?結果與分析

2.1 ?醋酸棉酚對蛋雞血清生化指標的影響

由表2可知，醋酸棉酚對血清中AST、ALT的影響呈現時間和劑量效應。與對照組比較，試驗第2周時，H組血清中LDL-C顯著升高（P<0.05）。第4周、第6周時，M、H組血清中TG和LDL-C有所升高，且差異極顯著（P<0.01）。第4周、第6周時，H組血清中CHOL顯著升高（P<0.05）， HDL-C顯著升高（P<0.05）。

2.2 ?醋酸棉酚對蛋雞肝臟中脂肪酸組成的影響

肝臟中脂肪酸組成測定結果見表3。由表3可以看出，試驗組和對照組均未能檢測出肉豆蔻酸和亞麻酸;與對照組比較，3個試驗組棕櫚酸和硬脂酸含量隨著醋酸棉酚添加量的增加有升高的趨勢，但差異不顯著;棕櫚油酸、亞油酸含量隨著棉酚添加量的升高逐漸降低，H組中未檢測出油酸，M組油酸顯著降低（P<0.05）。棉酚使蛋雞肝臟飽和脂肪酸升高，不飽和脂肪酸降低。

2.3 ?醋酸棉酚對蛋雞肝臟脂質過氧化指標的影響

肝臟氧化應激指標測定結果見表4。由表4可以看出，與對照組比較，L組各項脂質過氧化指標與對照組不存在顯著差異（P>0.05）;M組GSH-Px活性顯著降低（P<0.05），SOD活性、GSH含量極顯著降低（P<0.01）;H組SOD、GSH-Px、GSH均極顯著降低（P<0.01）; M組和H組MDA含量均極顯著升高（P<0.01）。

2.4 ?醋酸棉酚導致蛋雞肝臟組織的病理變化及其對肝臟超微結構的影響

肝臟病理切片觀察結果見圖1。結果表明，對照組肝臟部分肝細胞胞漿內有少量小脂肪滴;低劑量組肝臟中局部肝細胞胞漿內有大量大脂肪滴;中劑量組肝臟中局部肝細胞胞漿內有大量較大脂肪滴;高劑量組肝臟中局部肝細胞胞漿內有大量大脂肪滴。相比于飼喂含醋酸棉酚日糧的蛋雞，尤其是高劑量組的蛋雞，對照組肝臟組織中發生明顯的脂肪變性，肝臟結構紊亂，炎性細胞浸潤，基本輪廓消失。

肝臟組織超微結構觀察結果見圖2。由圖2可知，對照組線粒體內外膜結構完整，嵴完整，清晰，表明其功能正常;低劑量組線粒體結構基本完整，個別內部結構模糊;中劑量組線粒體外膜結構完整，部分嵴斷裂，有空泡化的趨勢;高劑量組線粒體大部分嵴斷裂，內膜溶解，呈空泡化（圖中箭頭所示）。與對照組相比，試驗組存在不同程度的脂滴增加的情況，且細胞中空泡數量增多。

3 ?討論

游離棉酚的毒性主要是其結構中含有醛基和羥基，其在動物體內肝臟中會發生明顯的蓄積作用[10]。日糧中添加棉粕會導致肝臟組織脂肪變性，肝小葉變性壞死。病禽剖檢后發現為肝充血，膽囊腫大。已有的研究認為，棉酚與金屬離子結合，破壞了離子原有的功能。棉酚與鐵離子結合，干擾血紅蛋白的合成，引起機體缺鐵性貧血;與氨基酸殘基結合，可使一些蛋白質及蛋白酶類失去活性。1976年，Abou-Donia[11]通過同位素標記技術研究了棉酚在肝臟亞細胞結構中的分布，發現棉酚主要聚集在微粒體和線粒體膜上，在胞核內的含量則很少。

AST和ALT是肝功能檢查中的一項重要指標，其偏高提示肝臟可能出現不同程度的損傷，如急性肝炎、酒精肝和脂肪肝等。丁耿芝等[12]研究表明，隨著游離棉酚含量的增加，ALT和AST呈上升趨勢，表明肝臟受到一定程度的損害。Braham等[13]和Abou-donia等[14]研究顯示，棉酚可引起肝臟損傷，導致AST活性升高。楊茹潔[15]也發現高棉酚飼糧對蛋雞AST的活性影響極顯著，并且有時間效應。本試驗中也發現此變化，呈現時間與劑量效應。血清中LDL-C、TG、CHOL、HDL-C等指標的變化，提示蛋雞攝入游離棉酚后出現肝臟損傷和脂肪沉積。這與焦洪超等[16]的研究結果較為相似，蛋雞飼料中添加棉酚后造成蛋雞肝臟脂肪代謝異常。通過對脂肪酸組成的研究發現，游離棉酚影響了肝臟的脂肪酸組成，導致飽和脂肪酸升高、不飽和脂肪酸下降。

動物機體在正常情況下，處于動態的氧化平衡中，當機體受到不良應激時，該平衡就會被打破，表現為抗氧化能力降低或機體產生過多的氧自由基[17]。SOD在細胞漿中和線粒體基質中起重要的防御作用[18]， SOD是機體抗脂過氧化酶促防御系統中的一個重要酶，能有效清除氧自由基。GSH-Px可清除線粒體及胞漿中所產生的H2O2和脂類中的H2O2。MDA為脂質過氧化產物，當機體氧自由基升高時，MDA也會顯著升高。當自由基在高濃度時，會引起機體氧化損傷。同時會造成DNA、蛋白質及脂肪損傷。其中脂肪損傷主要攻擊的對象是不飽和脂肪酸。在細胞內，棉酚可以結合在內質網和線粒體膜，同時棉酚與氨基酸非特異性共價結合使棉酚成為普遍的酶抑制劑[19]。本研究表明，隨著棉酚劑量的增加，蛋雞肝臟中SOD、GSH-Px活性逐漸降低，MDA含量逐漸升高，且呈一定的劑量效應關系，表明棉酚引起蛋雞肝臟的氧化損傷，這也是造成肝細胞脂肪沉積的原因之一。

張志峰等[20]研究報道， 飼糧游離棉酚含量為162.5 mg/kg時，導致育肥豬中毒死亡，剖檢發現其肝臟體積增大，質地變硬，呈現暗紅色，腹腔中有大量炎性滲出物，切片觀察發現部分肝細胞萎縮壞死，結構模糊，小葉間纖維結締組織增生，間隔增寬。劉錫民[21]報道，棉酚中毒患者臨床上均有不同程度的肝細胞萎縮和輕度脂肪變性。焦洪超[7]研究發現飼喂40、200 mg/kg棉酚及腹腔注射棉酚導致蛋雞肝臟組織結構紊亂，肝細胞輪廓消失，腫脹、炎性浸潤，并且有明顯的脂肪變性。本研究發現游離棉酚導致肝臟最主要的病理變化就是肝細胞脂肪變性，進一步對肝細胞超微結構觀察發現，游離棉酚對線粒體產生損傷，并且呈一定的劑量效應。因此，肝細胞中脂肪的堆積可能與線粒體受損導致的氧化功能下降有關，而線粒體的受損又進一步加劇了肝細胞的氧化應激。

綜上所述，醋酸棉酚引起蛋雞肝臟細胞氧化應激損傷，導致線粒體等細胞器功能受損氧化功能下降在蛋雞肝臟的脂肪沉積過程中發揮了重要作用。

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