當歸藤中總黃酮提取工藝優化及其含量測定

盧森華 劉佳明 張鳳懿

摘要：為優化當歸藤（Embelia parviflora Wall）中總黃酮提取工藝，在單因素試驗的基礎上，以提取溶劑體積分數、料液比和提取時間為影響因素，采用L9（34）正交試驗優化當歸藤中總黃酮的最佳提取工藝。結果表明，提取溶劑體積分數、料液比和提取時間對當歸藤中總黃酮提取率均有顯著影響，優化后的當歸藤中總黃酮的最佳提取工藝為50%乙醇溶液料，液比1∶200，提取時間120 min，蘆丁質量濃度在9.16～54.96 μg/mL（r=0.999 8）范圍內線性關系良好，平均回收率為97.6%（n=6），RSD為2.2%。

關鍵詞：當歸藤（Embelia parviflora Wall）;總黃酮;含量;提取工藝

中圖分類號：TQ461 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）10-0123-004

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.10.029 ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： To establish the extraction technology and content determination method of total flavonoids in Embelia parviflora Wall. On the basis of single factor experiment， the optimum extraction technology of total flavonoids from Embelia parviflora Wall was optimized by L9（34）orthogonal test， and the content of total flavonoids in Embelia parviflora Wall was determined. ? Results showed that the extraction solvent concentration， the ratio of material to liquid， and the extraction time all had significant effects on the extraction rate of total flavonoids from Embelia parviflora Wall. The optimum extraction technology of total flavonoids from Embelia parviflora Wall was material-liquid ratio of 1：200， and reflux extraction at 100 ℃ in water bath for 120 min. The linear relationship of rutin concentration was good in the range of 9.16～54.96 μg/mL（r=0.999 8）. The average recovery was 97.6%（n=6）， and RSD was 2.2%.

Key words： Embelia parviflora Wall; total flavonoids; content; extracting techonology

當歸藤為紫金牛科植物小花酸藤子（Embelia parviflora Wall）的根與老莖，別名土當歸、篩其蔃等，分布于廣西、云南等地，全年均可采[1]。其味苦、澀，性溫，具有活血、補血、益精壯陽、強腰膝的功效，常用于治療血虛諸癥、跌打骨折、腰腿酸痛等病癥[2，3]。當歸藤的化學成分復雜，目前從當歸藤中分離得到的化合物包括黃酮類、萜類、甾體類等[4-6]。現代藥理研究表明，當歸藤具有抗炎、鎮痛、抗凝血等藥理作用[7，8]。當歸藤中黃酮類成分含量較多，目前已有學者對當歸藤中總黃酮的提取工藝[9]及其含量測定方法[10]進行了初步考察，但總黃酮的提取工藝有待進一步優化，測定方法中對照品的選擇及顯色方法方面都存在欠缺。因此，本試驗采用正交試驗優化當歸藤中總黃酮的最佳提取工藝， 并測定其含量，以期為當歸藤資源深度開發提供科學依據。

1 ?材料與方法

1.1 材料

1.1.1 ?藥材與試劑 ?試驗所用當歸藤樣品經廣西中醫藥大學陳勇教授鑒定為紫金牛科植物小花酸藤子的干燥根與老莖。蘆丁標準品（批號0080-9705，中國藥品生物制品檢定所）;甲醇、無水乙醇、硝酸鋁[Al（NO3）3]、亞硝酸鈉（NaNO2）、氫氧化鈉（NaOH）均為分析純，廣東光華科技股份有限公司。

1.1.2 儀器 ?紫外-可見分光光度計（8453型，美國Agilent公司）;超級恒溫水浴鍋（501型，金壇市醫療儀器廠）;電子天平（BP211D型，德國Sartorius公司）;超聲清洗儀（B35005-MT型，上海必能信公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準品溶液的制備 ?精密稱取蘆丁標準品（120 ℃干燥至恒重）5.72 mg，置于25 mL容量瓶中，加50%乙醇溶液適量使溶解，再用50%乙醇溶液定容，搖勻，即得濃度為0.229 mg/mL的標準品溶液。

1.2.2 檢測波長的確定 ?取蘆丁標準品溶液及樣品溶液各2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，首先加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置5 min，然后加10% Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，靜置5 min，再加4% NaOH溶液10 mL，用50%乙醇溶液定容，搖勻，靜置10 min，以50%乙醇溶液為參比。利用UV-Vis法在200～800 nm掃描，結果在508 nm處蘆丁有最大吸收，故確定508 nm為測定波長（圖1、圖2）。

1.2.3 ?標準曲線的建立 ?精密量取蘆丁標準品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，經過5% NaNO2溶液-10% Al（NO3）3溶液-4% NaOH溶液顯色后，利用UV-Vis法在508 nm處測定標準品溶液吸光度，結果見圖3。以蘆丁質量濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程：y=12.26x+0.007 7，R2=0.999 8。

1.2.4 ?樣品溶液的制備及總黃酮含量的測定 ?精密稱定當歸藤樣品0.5 g置于250 mL磨口錐形瓶中，按單因素試驗中不同的提取條件進行提取。精密量取樣品溶液1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，經過5% NaNO2溶液-10% Al（NO3）3溶液-4% NaOH溶液顯色后，利用UV-Vis法在508 nm處測定樣品溶液的吸光度，并計算當歸藤中總黃酮的含量。

1.2.5 ?正交試驗 ?采用L9（34）正交設計表進行試驗設計，在單因素試驗基礎上，進一步考察提取溶劑體積分數（A）、液料比（B）、提取時間（C）對當歸藤中總黃酮提取率的影響，以確定當歸藤中總黃酮的最佳提取工藝。因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1 提取方法考察 ?取當歸藤樣品3份（每份0.5 g），置于250 mL磨口錐形瓶中，加入50%乙醇溶液50 mL，分別采用靜置、水浴加熱回流、超聲3種方法提取1.0 h后過濾，取續濾液1.0 mL，分別置25 mL量瓶中，測定結果如圖4所示。由圖4可以看出，使用水浴加熱回流提取方法時當歸藤中總黃酮的含量最高。

2.1.2 ?提取溶劑考察 ?取當歸藤樣品2份（每份0.5 g），置于250 mL磨口錐形瓶中，分別加入50%乙醇溶液和50%甲醇溶液各50 mL，水浴加熱回流提取1.0 h后濾過，取續濾液1.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，測定結果如圖5所示。由圖5可以看出，使用50%乙醇溶液為提取溶劑時得到當歸藤中總黃酮的含量較高。

2.1.3 ?提取次數考察 ?取50%乙醇溶液提取1次后的當歸藤藥渣，再加入50%乙醇溶液50 mL，水浴加熱回流提取1.0 h后濾過，取續濾液1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，測定結果如圖6所示。由圖6可以看出，提取1次后，當歸藤中總黃酮含量下降較多，考慮到生產工藝對時間的要求和溶劑的損耗，提取次數以1次為宜。

2.1.4 ?提取溶劑體積分數考察 ?取當歸藤樣品4份（每份0.5 g），置于250 mL磨口錐形瓶中，分別加入30%、50%、70%、95%乙醇溶液各50 mL，水浴加熱回流提取1.0 h后過濾，取續濾液1.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，測定結果如圖7所示。由圖7可以看出，使用50%乙醇溶液為溶劑體積分數時得到當歸藤中總黃酮的含量最高。

2.1.5 ?提取時間考察 ?取當歸藤樣品4份（每份0.5 g），置于250 mL磨口錐形瓶中，加入50 mL 50%乙醇溶液，分別水浴加熱回流提取10、30、60、120 min后過濾，取續濾液1.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，測定結果如圖8所示。由圖8可以看出，提取時間為60 min時得到當歸藤中總黃酮的含量最高。

2.1.6 料液比考察 取當歸藤樣品3份（每份0.5 g），置于250 mL磨口錐形瓶中，料液比分別為1∶50、?1∶100、1∶200，水浴加熱回流提取1.0 h后過濾，取續濾液1.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，測定結果如圖9所示。由圖9可以看出，料液比為1∶100時得到當歸藤中總黃酮的含量最高。

2.2 ?正交試驗結果

從表2可知，影響當歸藤中總黃酮提取率的主次因素為A>B>C，即提取溶劑體積分數>料液比>提取時間，3因素中A2>A3>A1，B3>B2>B1，C3>C2>C1。從方差分析結果（表3）可知，提取溶劑體積分數、提取液料比和提取時間均有顯著性差異（P<0.05），確定當歸藤中總黃酮最佳提取工藝為A2B3C3，即50%乙醇溶液，液料比為1∶200、100 ℃水浴加熱回流提取120 min。

2.3 方法學考察結果

2.3.1 精密度試驗 ?精密吸取蘆丁標準品溶液2.0 mL，連續測定6次。結果表明，蘆丁標準品溶液吸光度平均值為0.58，RSD為0.04%，該方法精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 ?精密稱定同一批當歸藤樣品（百色金秀）6份，每份0.5 g，置于250 mL磨口錐形瓶中，測定吸光度并計算當歸藤中總黃酮含量。結果表明，當歸藤中總黃酮平均含量為11.77%，RSD為1.0%，該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 ?取供試品溶液1份，在30 min內每隔5 min測定吸光度。結果表明，當歸藤樣品溶液的吸光度平均值為0.59，RSD為1.2%，該方法穩定性良好。

2.3.4 加樣回收試驗 ?精密稱定已知含量（含量為11.77%）的當歸藤樣品（百色金秀）6份，每份0.25 g，置于250 mL磨口錐形瓶中，分別加入蘆丁對照品29.43 mg，測定吸光度，并計算當歸藤中總黃酮的回收率，結果見表4。由表4可以看出，當歸藤中總黃酮的平均回收率為97.6%，RSD為2.2%。

2.4 ?樣品測定

精密稱定6個產地當歸藤樣品各0.5 g，置于250 mL磨口錐形瓶中，測定吸光度并計算當歸藤中總黃酮含量結果見表5。、

3 ?討論

目前，測定中藥中總黃酮的含量較常用的方法是比色法（UV-Vis法），主要依據總黃酮成分特征性的結構具有特定的顯色反應，利用適當的顯色劑顯色，在適當的波長下測定吸光度，從而實現對化學結構上具有共同特征的總黃酮成分定量[11，12]。本試驗采用UV-Vis法測定當歸藤中總黃酮含量，精密度、重復性、穩定性和回收率均達到定量分析的方法學考察的要求，且簡便易行。

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