高效液相色譜法測定輔食營養補充品中維生素B1含量

廖雯意 肖之敏 莫益倩 雷艷

摘 要：采用高效液相色譜法檢測輔食營養補充品中維生素B1的含量。樣品在稀鹽酸介質中恒溫水解、中和后酶解，水解液用活性人造沸石凈化，凈化液用堿性鐵氰化鉀溶液衍生，正丁醇萃取后經C18反相色譜柱分離，用高效液相色譜-熒光檢測器檢測，外標法定量。通過優化前處理方式調整衍生液濃度以及樣品凈化的方式，本方法標準曲線相關系數≥0.999，加標回收率在95.2%～99.0%，保留時間穩定且重復性好，RSD值為1.0%，衍生液濃度在40～60 g·mL-1，結果顯示本方法適用于檢測維生素B1含量較高的輔食營養補充品，減少雜質干擾結果準確度高。

關鍵詞：輔食;營養補充品;維生素B1;高效液相色譜-熒光檢測器

Abstract：The content of vitamin B1 in supplementary food supplements was determined by HPLC. The sample was hydrolyzed at constant temperature in dilute hydrochloric acid medium， neutralized and then enzymolysis. The hydrolysate was purified by active artificial zeolite， and the purification solution was derived from basic potassium ferricyanide solution. After extraction with n-butanol， it was separated by C18 reversed-phase chromatographic column， detected by HPLC-fluorescence detector， and quantified by external standard method. The correlation coefficient of standard curve was ≥ 0.999， the recovery rate was 95.2%～99.0%， the RSD value was 1.0%， and the concentration of derivative solution was in the range of 40～60 g·mL-1 Less impurity interference and high accuracy.

Key words：Complementary food; Nutritional supplement; Vitamin B1; High performance liquid chromatography fluorescence detector

中圖分類號：O657.7

輔食營養補充品是一種含多種微量營養素（維生素和礦物質等）的補充品，其中含或不含食品基質和其他輔料，大多數添加在6～36個月齡嬰幼兒即食輔食中食用[1-2]，常用的形式有輔食營養素補充食品、輔食營養補充片、輔食營養素撒劑。維生素B1是人體必需的營養物質[3]，易溶于水，在堿性條件下易分解變質，在酸性條件中較為穩定，遇光和熱效果下降。輔食營養補充品中維生素B1含量較高，國家標準

GB 5009.84-2016第一法高效液相色譜法對較高含量的樣品檢測不穩定，基于此，對標準進行優化，從調整衍生劑的濃度和增加樣品的凈化步驟進行前處理上機。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設備

（1）材料。強化綜合營養素、維生素B1（鹽酸硫胺素）≥99.0%、正丁醇（HPLC級）、鐵氰化鉀（AR）、氫氧化鈉（AR）、鹽酸（AR）、甲醇（HPLC）、氯化鉀（AR）、冰乙酸（AR）、木瓜蛋白酶（酶活力≥800 U·mg-1）、淀粉酶（酶活力≥3 700 U·g-1）、人造沸石（40～60目）。

（2）儀器。高效液相色譜儀-熒光檢測器（Agilent 1200型）、高壓蒸汽滅菌鍋（致微GI80DWS）、萬分之一電子天平（梅特勒-托利多，ML204-02型）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

（1）試液提取。準確稱取樣品約0.5 g于50 mL錐形瓶中，加入30 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液與樣品混勻，塞上軟塞放入高壓滅菌鍋120 ℃保持30 min，水解結束待冷卻拿出。此時樣品水解液pH為2.0～2.5，用10 g·L-1的氫氧化鈉溶液調至pH為4.5，加入2 mL混合酶溶液（木瓜蛋白酶1.76 g/50 mL+淀粉酶1.27 g/50 mL），搖勻后置于37 ℃培養箱中放置約16 h，將酶解液轉至50 mL比色管中，用水定容至刻度線，搖勻，離心取上清液備用，同時做空白試驗[4-6]。

（2）樣品凈化。用少許脫脂棉鋪于層析柱底部，加水將棉中氣泡排出加入已活化好的活性人造沸石約8 g（高度不低于45 mm），液面不低于活性人造沸石。準確加入20 mL上述樣品提取液，以流速1滴/s通過裝好的凈化柱，加入10 mL近沸騰的熱水沖洗凈化柱，棄去淋洗液，如此重復2次。于層析柱下放置25 mL比色管收集洗脫液，加入20 mL溫度約為90 ℃的酸性氯化鉀洗脫溶液，流速保持1滴/s，待洗脫液冷卻至室溫后用250 g·L-1酸性氯化鉀定容搖勻，即為凈化液[4]。

（3）試液衍生。準確移取上述凈化液2.0 mL于10 mL試管中，加入2.0 mL堿性鐵氰化鉀溶液（分別加入20、30、40、60 g·mL-1），渦旋混勻后，準確加入2.0 mL正丁醇，再次渦旋混勻約2 min后靜置10 min，

約樣品出現乳化現象應轉至離心管離心處理，待分層后取上層正丁醇萃取層經0.45 μm有機微孔濾膜過濾至棕色進樣品中，待上機檢測[7]。

1.2.2 標準溶液配制

（1）維生素B1儲備液。稱取標準樣品0.012 78 g，用0.1 mol·L-1鹽酸溶液定容至25 mL容量瓶中，搖勻，此時儲備液濃度為506 μg·mL-1。置于0～4 ℃冰箱中保存期為3個月。

（2）維生素B1中間液。吸取2.0 mL標準儲備液至100 mL容量瓶，用水稀釋并定容至刻度線，搖勻，此時溶液濃度為10.12 μg·mL-1。臨用前配制。

（3）維生素B1標準系列工作液。分別吸取0、50、100、200、400、800 μL和1 000 μL，用水定容至10 mL容量瓶，標準系列工作液中維生素B1的濃度分別為0、0.051、0.101、0.202、0.405、0.810 μg·mL-1和1.010 μg·mL-1。臨用前配制，與樣品同時衍生。

1.2.3 儀器條件設定

色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-Aq 4.6×250 mm?5 μm;柱溫：30 ℃;流動相：0.38 g/500 mL乙酸銨+甲醇（65+35）;流速：1.0 mL·min-1;檢測波長：激發波長375 nm、發射波長435 nm;進樣量：20 μL。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

將標準系列工作液衍生物注入高效液相色譜進行維生素B1的測定，繪制校正曲線，曲線相關系數為0.999 78，如圖1所示，標物級別和含量見表1。

2.2 精密度實驗

樣品通過上述方法進行6次重復性測試，結果見表2，RSD值為1.0%（n=6）。

2.3 樣品檢測

樣品加入不同濃度衍生劑后，隨著衍生劑的濃度越高，結果越大，數據結果見表3，樣品1組和2組衍生劑濃度低滿足不了樣品衍生完全，實驗樣品到第3、4組后衍生劑濃度可以滿足樣品衍生的終結點，結果數據穩定。樣品前處理圖譜如圖2、圖3所示。

2.4 加標回收實驗

將已知濃度為10.12 μg·mL-1的維生素B1標準溶液加入4組試驗樣品中，結果見表4，每組分別加入0.5、2.0、4.0 mL標準溶液。樣品1組加標回收率最低，為43.5%～69.6%，樣品2組回收率范圍偏低，為70.7%～80.6%，3組和4組的回收率達到90%以上，范圍在95.2%～99.0%。

3 結論

維生素B1在檢測過程中易受水分、溫度、微量元素等各種因素的影響而降解[8]，沸石具有較強的吸附性，樣品通過活化后的人工沸石凈化后，凈化提取液加入衍生檢測。實驗結果顯示通過凈化除去雜質干擾以及增加衍生劑濃度的方法第1組以及第2組檢測數據因衍生劑濃度較低，樣品終結點較高不能完全衍生;第3組和第4組衍生劑濃度40～60 g·mL-1滿足樣品衍生反應終結點，回收率范圍在95.2%～99.0%，結果穩定。此實驗方法對含有維生素B1較高的樣品檢測除去干擾及結果穩定準確，適用于輔食營養補充品中維生素B1的含量測定。

參考文獻：

[1]傅紅雪，陳萬勤，劉 柱，等.3種前處理-HPLC法測定嬰幼兒配方食品中維生素B1[J].食品工業，2020（4）：281-285.

[2]邱清蓮，秦 菁，黃成安，等.含葡萄籽提取物的保健中品維生素B1含量的測定[J].食品安全質量檢測學報，2018（23）：6267-6271.

[3]范 玲，藺丹華，侯 賽，等.花生維生素檢測方法的研究進展[J].現代食品，2020（7）：15-16.

[4]國家衛生和計劃生育委員會.GB 5009.84-2016食品中維生素B1的測定[S].北京：中國標準出版社，2017.

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[6]倪煒華，陳 妍，邊國軍.嬰幼兒配方奶粉中維生素B1的檢測及其衍生物穩定性的研究[J].中國乳品工業，2018（12）：43-45.

[7]陶大利，李 琴，白 鶴.乳制品中維生素B1檢測條件優化研究[J].現代食品，2018（20）：120-124.

[8]李 蘭，賈 靜，肖志明，等.利用沸石吸氨氮機理解決預混合飼料中維生素B1的準確度研究[J].中國飼料，2020（1）：64-67.

作者簡介：廖雯意（1992—），女，本科，助理工程師;研究方向為食品及相關產品的檢測。