基于HPLC-ELSD法測定食醋中5種還原糖的含量

凌蕾 張季 向麗萍 王蘭蘭 駱書娜 王奧

摘 要：目的：建立一種同時測定食醋中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的高效液相色譜法。方法：食醋樣品經處理后，采用HPLC-ELSD，以果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖為對照品，固定相為Agilent ZORBAX NH2 （250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（70∶30）。結果：5種還原糖在色譜柱上得到有效的分離，在0.5～10.0 mg·mL-1范圍內呈良好的線性關系，平均加樣回收率在97.19%～104.03%，相對標準偏差（RSD）為2.12%～3.27%。對兩個不同企業赤水曬醋進行測定分析，結果顯示不同企業以及不同年份的赤水曬醋中糖含量有較大的差異。結論：該方法結果準確，重現性好，適用于食醋中糖含量的測定。

關鍵詞：高效液相色譜;蒸發光散射檢測器;食醋;糖

Abstract：Objective： To establish a determination HPLC-ELSD method for the simultaneous analysis of fructose，glucose，sucrose， maltose and lactose in vinegar. Methods： Vinegar sample was pretreated and then determined by HPLC-ELSD. Fructose， glucose， sucrose， maltose and lactose as the standard substance， Agilent ZORBAX NH2 （250 mm×

4.6 mm， 5 μm） was adopted， the mobile phase was composed of acetonitrile-water （70∶30）. Results： Five sugars could be well separated， and have good linearity relationship in 0.5～10.0 mg·mL-1， the average recoveries were 97.19%～104.03%， and the RSD were 2.12%～3.27%. By measuring and analyzing of chishui sun vinegar samples from two different enterprises，the result showed that the content of sugar in chishui sun vinegar were different between different enterprises and years. Conclusion： The results showed that the method is simple，accurate and repeatable and it is suitable for the analysis of fructose， glucose， sucrose， maltose and lactose in vinegar.

Key words：HPLC; ELSD; Vinegar; Sugar

中圖分類號：O657.72

食醋作為一種大眾化的酸性調味品，具有助消化、抗衰老和潤膚美容、抑制血糖升高、減少結石發生、抗癌等作用[1]。食醋有著悠久的制作工藝歷史，傳統食醋制作工藝主要以大米、糯米、高粱、玉米、小米和水果等為原料，經過發酵釀制而成。在釀造發酵過程中因有大量微生物參與，能夠產生各種有機酸、還原糖、氨基酸、黃酮、多酚等多種營養成分，賦予食醋獨特的保健功能并且影響食醋的風味、品質以及出醋率等[2]。食醋中糖主要來源于在生產過程中添加的蔗糖和生產原料的糖化。糖作為影響食醋風味重要的因素之一，是醋中甜味的重要來源，不僅能減輕酸帶來的刺激，還能增加食醋的色澤和稠厚度[3]。

食醋中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖屬于還原糖，目前還原糖的測定方法主要包括高錳酸鉀滴定法、斐林試劑滴定法、比色法等化學法，以及近紅外吸收光譜快速測定法、高效液相色譜法等[4-5]。其中化學法不僅耗時長、操作復雜，還無法對其進行準確定性和定量分析。目前有文獻報道高效液相色譜串聯示差折光檢測器應用于測定食醋中糖含量，但示差折光檢測器有靈敏度較低、系統平衡時間較長等缺點，同時溫度、流速、基線噪音等因素對目標化合物的分離影響較大[6]。而蒸發散射檢測器（ELSD）測定食醋中糖含量的穩定性好、靈敏度比示差折光法有更高的優勢，并且高效液相色譜串聯蒸發光散射檢測器對食醋中糖進行定性和定量的檢測少有報道。因此，本文采用高效液相色譜串聯蒸發光散射檢測器，建立一種對食醋中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖同時測定的高效液相色譜法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1260高效液相色譜儀、1260蒸發光散射檢測器（美國Agilent公司）、臺式高速冷凍離心機（美國Sigma公司）、SEP-PARK C18固相萃取柱（美國沃特世公司）、Milli-Q超純水系統（密理博中國有限公司）。

果糖（純度>99.7%）、葡萄糖（純度>99.4%）、蔗糖（純度>99.9%）、麥芽糖（純度>94.9%）、乳糖（純度>94.8%），均購自Dr Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈：色譜純，購自美國天地公司;高純氮氣：純度大于99.99%;食醋樣品：市售。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品預處理

準確移取食醋樣品5 mL置于50 mL離心管中，加入20 mL去離子水，渦旋混合30 s，12 000 r·min-1離心5 min。取上清液5 mL，待凈化。

1.2.2 凈化

用5 mL甲醇和10 mL水活化C18固相萃取柱，取1.2.1項下5 mL上清液通過預先活化好的C18固相萃取柱凈化，棄去初始的2 mL凈化液，收集1.5 mL凈化液，經0.45 μm微孔濾膜過濾至樣品瓶，待測。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈∶水=70∶30;流速：1.0 mL·min-1;進樣體積10 μL;色譜柱溫度：35 ℃。

1.3.2 檢測器條件

蒸發光散射檢測器檢測漂移管溫度：40 ℃;載氣流速：1.2 mL·min-1。

1.4 標準溶液制備

精密稱取果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖標準品100.00 mg，用水溶解并定容至10 mL容量瓶中，配成濃度為10 mg·mL-1的混合標準品儲備溶液。置于4 ℃保存，待用。

1.5 標準曲線繪制

精密量取不同體積的1.4項下混合對照品儲備液置于10 mL容量瓶，用水定容至刻度，搖勻，配制成一系列的混合對照品溶液。依次按照1.3項下的分析條件進行測定，分別以果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的濃度（mg·mL-1）作為橫坐標（X），測定的峰面積作為縱坐標（Y），繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的確定

以食醋樣品為考察對象，對樣品前處理方法進行探討。由于食醋中含有蛋白質、色素、有機酸等營養物質，若采用直接稀釋測定糖類成分有較大的干擾，并且容易對色譜柱造成損害[7]。因此，前期樣品處理將這些雜質分離非常重要。

方法一，選擇常用的蛋白質沉淀劑亞鐵氰化鉀和乙酸鋅，根據文獻中報道測定食品中糖含量的前處理方法，先加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉降食醋中的蛋白質后，再根據色素、有機酸物質在C18柱上的保留時間長，而糖的保留時間短。將沉淀蛋白后的樣品用SEP-PARK C18固相萃取柱分離[8-9]。本實驗結果發現糖類物質通過該方法處理后受到抑制。

方法二，則根據1.2項下樣品前處理方法進行，其中稀釋倍數為4倍，前處理方法考察中發現當樣品用水稀釋2倍時雜質干擾太大，當稀釋10倍或50倍時多數樣品中糖的檢測低于檢出限。選擇用4倍稀釋后用SEP-PARK C18固相萃取柱凈化。進樣測定后分析，根據對照品圖譜的保留時間確定食醋樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的組分，出峰時間分別為8.28、9.26、11.99、14.31 min和16.17 min。對照品及樣品色譜圖分別見圖1、圖2。結果發現該方法處理后樣品能較好地去掉干擾雜質，并且操作過程簡單。因此，該方法確定為本實驗樣品的前處理方法。

2.2 流動相的考察

本實驗以乙腈和水為流動相，通過改變乙腈和水的混合比例，確定能分離5種對照品以及食醋樣品中5種糖的最佳條件。分別考察了85∶15，80∶20，70∶30的等度洗脫條件以及初始流動相為80∶20梯度洗脫條件，發現梯度洗脫條件80∶30時5種糖的出峰時間均靠后并且不能完全分開。而等度洗脫條件中，以乙腈、水比例為70∶30時，出峰時間適合，且樣品中5種糖能與雜質很好的分離。因此，最終選擇的最佳流動相比例為乙腈∶水=70∶30的等度洗脫條件。

2.3 蒸發光散射檢測器條件的考察

蒸發光散射檢測器中載氣流量和漂移管溫度是影響化合物的基線噪音和靈敏度的兩個重要因素。在乙腈∶水為70∶30，流速為1 mL·min-1的色譜條件下，對5種糖的混合標準溶液進行測定，通過調整載氣流量分別為1.0、1.3、1.4 L·min-1和漂移管溫度分別為30、40、50、60、70、70 ℃和80 ℃，最終確定靈敏度達到最高，基線穩定時的最佳條件載氣流速為1.2 mL·min-1，漂移管溫度為40 ℃。

2.4 線性關系及相關系數

在1.3的分析條件下，將配制好的系列對照品溶液分別測定并計算，回歸方程及相關系數見表1。由表1可以看出，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的濃度與峰面積之間的線性關系均良好，且標準曲線的相關系數R2均在0.999以上，表明該標準曲線準確可信，5種糖的檢測范圍在0.5～10.0 mg·mL-1。

2.5 方法檢出限

將果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的色譜峰高與基線信號之比接近3的濃度為最低檢測濃度。本實驗果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的檢出限分別為15.00、7.00、8.00、10.00 mg·mL-1、和15.00 mg·mL-1。

2.6 精密度考察

將1.4項下混合對照品儲備液稀釋成濃度為10 mg·mL-1的溶液，經0.45 μm濾膜過濾，按照1.3項下的分析條件進行測定峰面積，連續進樣6次。計算果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的相對標準偏差分別為2.7%、2.8%、3.95%、2.9%和3.95%。該實驗結果表明儀器精密度良好。

2.7 重復性考察

取同一種食醋樣品，按照1.2項下前處理方法，儀器重復測定6次，記錄峰面積，蔗糖、麥芽糖和乳糖未檢出。計算果糖、葡萄糖的相對標準偏差分別為1.2%、0.9%，表明該方法測定還原糖含量重復性良好。

2.8 回收率考察

取食醋樣品5 mL（在現有定量限下進行測定，未檢出蔗糖、麥芽糖和乳糖）共12份，每6份一組，分別精密加入高、低兩種不同濃度的5種糖混合對照品溶液，按照1.2項下處理方法處理后，進行測定。結果見表2，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的平均回收率分別為104.03%、103.68%、97.19%、99.49%和99.48%。

注：ND表示含量低于方法檢出限，下同。

2.9 食醋樣品測定

赤水曬醋是一種受國家地理標志保護的產品，

1號和2～4號食醋樣品分別來自兩個赤水曬醋企業，不同生產企業，生產工藝略有不同[10-11]。利用該方法分別對兩個不同企業的赤水曬醋糖含量進行測定，樣品信息及測定結果見表3。結果表明，食醋中含糖的成分主要是果糖和葡萄糖，蔗糖和麥芽糖含量較少，4個樣品中乳糖含量低于檢測限。

3 結論

本實驗采用HPLC-ELSD法同時測定食醋中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖含量，靈敏度高，基線穩定，前處理方法簡單，回收率大于90%，RSD小于5%，適用于食醋中5種糖類物質進行定性和定量分析。測定和分析兩個不同企業的赤水曬醋，實驗結果表明不同企業赤水曬醋含量有較大的差異，且食醋中的糖主要為果糖和葡萄糖。該方法操作簡單，重現好，為眾多企業生產和質檢部門對食醋中糖含量的檢測、應用和監管提供重要的技術支撐。

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基金項目：貴州省質量技術監督局科技計劃項目“貴州地理標志產品赤水曬醋品質特征研究”（編號：2017kj010）;遵義市優秀青年科技創新人才培養項目“貴州省特色食品質量與安全研究及應用”（編號：遵優青科[2018]4號）;貴州省科技計劃課題“貴州匯川城郊現代農業科技示范園區”（編號：黔科合平臺人才[2016]5243-02號）。

作者簡介：凌 蕾（1993—），女，碩士，工程師;研究方向為食品檢測技術。

通信作者：王 奧（1986—），男，博士，高級工程師;研究方向為食品質量與安全風險。