miR-125b在大鼠頸動脈球囊損傷中的表達及其對血管平滑肌增殖和遷移的作用

王孝高　王穎　陳衛國　王孝榮　余朝文　孫勇　唐文波　陳世遠　官澤宇　高涌

【摘? 要】目的：分析microRNA-125b （miR-125b）在大鼠頸動脈球囊損傷模型中的表達及其對血管平滑肌細胞（arterial smooth muscle cells，ASMCs）增殖和遷移的作用。方法：建立大鼠頸動脈球囊損傷模型鼠，分離并培養ASMCs。使用腺病毒攜帶的miR-125b模擬物（mimics）轉染ASMCs，使用實時熒光定量多聚酶鏈反應（real time quantitative-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測轉染前后ASMCs中miR-125b表達水平。通過Cell Counting Kit-8檢測miR-125b對ASMCs增殖的影響;通過Transwell實驗及劃痕實驗檢測miR-125b對ASMCs遷移能力的影響。結果：成功建立大鼠頸動脈球囊損傷模型并制備頸動脈ASMCs。轉染miR-125b mimics，miR-125b的表達顯著上調（P<0.001）。過表達miR-125b后，ASMCs的增殖及遷移能力減弱（P均<0.05）。結論：miR-125b可以抑制ASMCs增殖及遷移。

【關鍵詞】miR-125b;頸動脈球囊損傷模型;血管平滑肌細胞;細胞增殖;細胞遷移

【中圖分類號】R54????? 【文獻標識碼】A????? 【文章編號】1672-3783（2020）09-0050-02

動脈硬化（Atherosclerosis，AS）的發展過程主要有三個時期：動脈內膜脂質斑紋期、纖維斑塊形成期以及粥樣斑塊形成期。粥樣斑塊形成期的AS常表現為有臨床癥狀的動脈缺血性病變，具體有冠狀動脈性心臟病、腦梗死及下肢動脈硬化閉塞癥（atherosclerosis obliterans， ASO）等^[1]。粥樣斑塊形成期AS的患者治療難度大且生活質量差^[2-3]_。

在動脈硬化的發生發展過程中，動脈血管壁平滑肌細胞（arterial smooth muscle cells，ASMCs）進行的增殖以及平滑肌細胞細胞的遷移都起到十分關鍵的作用。期研究表明，微小核糖核酸（miR，miR）與ASMCs的增殖和遷移密切相關。如miR-1298下調可以通過靶向連接蛋白間接調控血管平滑肌細胞的增殖及遷移，在新生血管內膜生長和功能中起到的作用^[4]。本研究通過探索miR-125b對ASMCs增殖和遷移的作用，以期為治療AS尋找新思路。

1 資料與方法

1.1 試驗試劑及儀器

主要試劑有：Trizol （life technologies）、 M-MLV （promega）、 dNTPs （promega） 、Bulge-LoopTM miRNA （廣州銳博）、Rnase Inhibitor （promega） 、SYBR Master Mixture （TAKARA）、oligod T （上海 生工）、DMEM（Gibco）、Transwell試劑盒（Corning）、0.25%胰酶（上?；瘜W試劑公司）、胎牛血清（GIBCO）、胎牛血清 FBS（Ausbian）、結晶紫（生工生物工程股份有限公司）。主要儀器有：Real time PCR儀 （MX3000p Agilent公司）、Nanodrop分光光度計（2000/2000C Thermo）、96孔板（Cornning）、生物安全柜（Thermo）、酶標儀（Tecan infinite）、CO2培養箱（SANYO）、熒光顯微鏡（奧林巴斯）、血球計數板（求精）、離心機（賽默飛世爾科技中國有限公司）、倒置顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司）。

1.2獲取ASMCs

以Wistar大鼠為研究對象，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/kg），解剖并游離頸動脈，穿刺頸動脈并將0.014mm 導絲插至膈肌水平，導絲引導下插入直徑1mm球囊，以0.10-0.15ml肝素生理鹽水充盈球囊，緩慢來回抽動3次血管內膜制備大鼠頸動脈損傷模型。對照組大鼠同等條件下進行麻醉及游離頸動脈，但不經過上述頸動脈損傷處理，同樣條件下與實驗組Wistar大鼠培養1周。處死并切取頸動脈標本，顯微器械分離去除血管內膜及外膜獲得動脈中層組織，采用眼科剪刀剪碎動脈中層組織，剪成1mm²左右不規則碎片，再將碎片置于含有20%胎牛血清的M199培養基中，再將組織懸液置于15ml離心管中800轉/分室溫下離心5分鐘，去除上清液，收集動脈中層組織碎片，待組織塊略干涸，緊貼瓶底后，加入2ml含20%胎牛血清的M199培養基，靜置培養直到增殖達到融合。平滑肌細胞原代培養存在多種形狀，常見的有帶狀、梭狀、星狀等，傳至第3代可獲得純化的動脈平滑肌細胞，應用a-action免疫組化進行平滑肌細胞的鑒定，獲取研究的ASMCs。

1.3 qRT-PCR

收集ASMCs，先以2000轉/分鐘離心5分鐘，移除上清液留存細胞沉淀液，將1 mL Trizol加至細胞沉淀液，于室溫下搖勻混合液，再靜置5分鐘，轉移至新的1.5 mL EP管中。EP管加入200微升氯仿，倒置后靜置10分鐘后，再以12800轉/分速度離心，再經過一系列處理后，待RNA沉淀基本透明時，加入RNase-free水至完全溶解，Nanodrop 2000/2000C分光光度計分析測定所抽提RNA的濃度及質量。RNA逆轉錄獲得cDNA：每1 nmoL引物加入RNase-free water 200μL，渦旋振蕩充分溶解，然后瞬時離心，配成終濃度為5μM引物儲存液。取5μM的RT引物儲存液1μL，加入79μL的RNase-free water，配制成62.5 nM的RT引物工作液。將2μL逆轉錄miR-125b引物（0.5μg/μL） 和2.0μg Total RNA 加入到 PCR 小管中， 補RNase-Free H2O至11μL;混勻后離心，70°C溫浴10 min;之后立即置于冰水混合物中冰浴，使逆轉錄引物和模板退火在上述混合物中按下表的比例，在冰浴中進行反應體系（25μL 體系）配制，混勻，短暫離心。上述體系在42°C水浴反應1h，然后在70°C水浴10 min使RT酶失活，將得到的逆轉錄miR-125b cDNA，置于-20°C保存備用。將1μLOligo dT（0.5μg/μL）和2.0μg Total RNA加入到PCR小管中，補充RNase-Free H2O至10μL，混勻后離心，70°C溫浴，10 min，之后立即置于冰水混合物中冰浴，使Oligo dT和模板退火，按下表的比例配制反應體系（冰上進行），混勻，短暫離心。miR-125b類似物序列：正向引物 5'-GCGCTCCCTGAGACCCTAAC-3'，反向引物 5'-TGCAGGGTCCGAGGTAT- 3'。最后應用實時熒光定量多聚酶鏈反應（real time quantitative-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測miR-125b的表達，采用SDS2.4軟件進行數據分析，Ct閾值設為0.2，對miR-125b在頸動脈損傷模型大鼠ASMCs表達進行分析。

1.4 ASMCs細胞轉染miR-125 mimics

將1×10⁵細胞置于24孔板中培養至貼壁，加入含6μg/ml嘌呤的培養基培養，并加入適量含miR-125b mimics的病毒，轉染4小時后加新鮮培養基稀釋嘌呤。繼續培養24小時后用新鮮培養基替換含嘌呤的培養基，48小時后使用qRT-PCR檢測轉染效率。

1.5 CCK-8檢測

將ASMCs置于96孔板中，分為對照組和miR-125b組，培養24小時后加入CCK-8試劑，并孵育1-4小時。最后酶標儀測定在450nm處的吸光度。

1.6 細胞Transwell試驗及劃痕試驗

將ASMCs加入Transwell上室，使用無血清培養基培養，分為對照組和miR-125b組。在24孔板中加入10%胎牛血清的培養基。將小室置于24孔板中培養6-8小時后取出上室，固定、染色，顯微鏡下計數遷移細胞數。

先在12孔背面劃上兩條橫線，將1.5×10⁵細胞置于12孔板中，分為對照組和miR-125b組。待細胞貼壁后劃痕并拍照，培養24h后拍照，計算劃痕遷移率。

1.7 統計學方法

本實驗數據采用SPSS18.0軟件進行處理，應用t檢驗分析兩組樣本間的數據。P<0.05表示差異顯著，有統計學意義。

2 結果

2.1 ASMCs中過表達miR-125b

從構建的15只Wistar大鼠頸動脈球囊損傷模型中提取ASMCs，并使用miR-125b轉染ASMCs。使用qRT-PCR檢測轉染效率發現，miR-125b在miR-125b組的表達約是其在對照組的2.3倍（P<0.001）（圖1，表1）。

2.2 過表達miR-125b對ASMCs增殖的影響

使用CCK8實驗比較miR-125b組和對照組ASMCs的增殖能力，結果顯示miR-125b組的OD450/fold值約是對照組的0.469倍（P<0.001）（圖2，表1）。這提示miR-125b可抑制ASMCs的增殖。

2.3 過表達miR-125b對ASMCs遷移的影響

使用劃痕實驗和Transwell遷移實驗比較miR-125b組和對照組ASMCs的遷移能力。劃痕實驗結果顯示miR-125b組的劃痕遷移率約是對照組的的0.881倍（P=0.009）（圖3A，表1）。Transwell遷移實驗結果顯示miR-125b組的細胞遷移倍數約是對照組的的0.716倍倍（P<0.001）（圖3B，表1）。兩組實驗均提示miR-125b可抑制ASMCs的遷移。

3 討論

動脈硬化的病理生理過程是一個多機制參與的復雜過程，其中微小核糖酸是該過程的重要調節因子。miR-125b在乳腺癌、膀胱癌及肝癌等腫瘤細胞的增殖和遷移中發揮作用。動脈硬化的發展過程和腫瘤轉移有相似之處，如ASMCs過度增殖、遷移導致血管內膜增厚。因此我們推測miR-125b在ASMCs的增殖和遷移過程中亦發揮作用。

近年來，越來越多的證據表明，microRNA可以通過調節VSMCs而影響AS的發生和發展。先前的研究已經證實miR-21，miR-1298和miR-22-3p參與了AS的發病機制。例如，miR-21可以通過靶向磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）來調節VSMC的增殖和遷移，從而影響AS的發病機理和進程。miR-1298的缺失與AS的CpG甲基化有關，而miR-1298的下調通過直接靶向連接蛋白43（connexin-43）來調節VSMC的增殖和遷移^[10]。miR-22-3p可靶向高機動性組合箱-1 （high mobility group box-1，HMGB1）而抑制ASMCs的遷移和增生能力。

綜述所述，以Wistar大鼠為研究對象，以球囊摩擦方法制備大鼠頸動脈損傷模型是可行的。

參考文獻

[1]? 尹智明， 余朝文. 下肢動脈硬化閉塞癥腔內介入治療的研究進展[J]. 中國普通外科雜志， 2017， 26（6）：789-793.

[2]? 陳世遠， 王孝高， 聶中林， 等. 辛伐他汀干預臨床前期下肢動脈硬化閉塞癥病程進展的臨床研究[J]. 中華解剖與臨床雜志， 2015， 20（2）：136-138.

[3]? 張宇， 張志偉， 吳繼東， 等. 膝以下動脈硬化閉塞癥的介入治療 [J]. 解剖與臨床， 2013： 18（5）：411-414.

基金項目：

蚌埠醫學院自然科學基金重點項目（BYKY1862ZD）;安徽省高校自然科學重大項目（KJ2016SD38）;安徽省科技攻關項目：（201904a07020020）