?耐鉛菌株的分離鑒定及其吸附特性研究

吳海維 周娜娜 姜宇 朱曙光 鮑立寧

摘 要：以某工廠處理水剩余污泥為菌種來源，經過分離、培養，篩選出一株最大耐Pb2+濃度為800 mg/L的耐鉛菌株，命名為J2，應用16S rDNA基因測序，結合形態觀察和生理生化特性試驗確定其類別，并對其Pb2+去除特性進行初步研究。結果表明：J2菌株屬于寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）細菌;其去除鉛的最佳pH值為9、最適接種量為5%、最適溫度為30℃、最佳發酵時間為96 h;根據J2菌株吸附鉛前后掃描電鏡結果，結合菌株生長曲線分析，認為J2菌株對鉛的去除機理包括前期表面吸附和后期胞內累積或轉化2種形式。該菌株可為重金屬污染土壤微生物修復提供菌種資源。

關鍵詞：土壤重金屬污染;耐鉛菌株;篩選;鑒定;吸附特性;吸附機理

中圖分類號：Q815， X172 文獻標識碼：A文章編號：1006-060X（2020）07-0005-04

Abstract： A lead-resistant strain survived in a maximum Pb2+ concentration of 800 mg/L was selected from the excess sludge of a plant and named J2 after isolation and culture. The obtained strain was subjected to 16S rDNA sequencing in succession to morphological observation， and physiological and biochemical charteristics tests. It was identified as Stenotrophomonas sp. based on 16S rDNA sequence similarity analysis. In addition， its Pb2+ removal characteristics was identified. The optimal lead adsorption conditions of this strain are pH 9，? inoculum concentration 5%， 30℃ and incubation 96 h. The repair mechanism of J2 strain is mainly cell surface adsorption at early stage and intracellular enrichment/transformation at late stage based on the analysis of the growth curve and scanning electron microscopy. Our studies confirm that the screened strain J2 has a good adsorption effect on lead and can provide bacteria resources for microbial remediation of heavy metal contaminated soil.

Key words： soil heavy metal pollution; lead-resistant strains; selecting; identification; adsorption characteristics; adsorption mechanism

在自然中大多數重金屬都以低濃度存在于土壤、水、巖石和生物群中，為生命系統提供必需的營養，一旦某種或某幾種重金屬的含量過高便會引起毒性。鉛是一種自然普遍存在的金屬，但是因為人類活動極大地提高了其在環境中的含量，例如鉛礦開采、使用鉛作為原料的工業過程、煤炭和石油的燃燒等活動[1]。由于鉛在土壤中的停留時間長，易通過水圈、大氣層影響生物圈，進而通過食物鏈影響人類的健康，因此，土壤中的鉛污染應引起人們的重視[2]。

為了保護環境，避免人類健康受損害，土壤重金屬污染的修復是國內外學者研究的熱點。微生物修復因為費用低、效果好、不會或很少造成二次污染，逐漸取代了傳統的物理修復和化學修復[3]。筆者擬以從某工廠處理水剩余污泥中篩選出的鉛耐性菌株為材料，應用16S rDNA基因測序，結合形態觀察和生理生化特性試驗確定其類別，并探索對其適宜生長環境條件，利用掃描電鏡對其鉛吸附機理進行初步分析，以明確其對重金屬鉛的吸附機制，為后期重金屬鉛污染生物修復的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及培養基

菌株篩選土壤樣品采自某工廠處理水剩余污泥。

基礎牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，加蒸餾水至1 000 mL;調節pH值至7.0～7.2;1×105 Pa滅菌20 min。如配置固體培養基添加20 g瓊脂。

選擇培養基：稱取16 g Pb（NO3）2溶于超純水，用容量瓶定容至100 mL，配置成濃度為100 g/L的鉛母液。將配置好的母液加入基礎培養基中，調節至相應濃度。

1.2 菌株的分離與篩選

稱取10 g污泥樣品于90 mL無菌水中，30℃、150 r/min搖床振蕩24～48 h，靜置后取上清液涂布在鉛濃度為200 mg/L的初篩培養基上，30℃培養24 h。在平板上挑選長勢較好的菌落進行劃線分離純化，將初篩得到的菌株分別接種到不同鉛濃度培養基中進行培養，逐步提高培養基中的鉛濃度（50、100、150… mg/L 逐漸遞增）進行復篩[4]，最終篩選出一株抗性最好的菌株，命名為J2，用于后續試驗。

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 菌株形態學觀察和生理生化特征鑒定 在基礎培養基中觀察菌落的形態、邊緣和顏色等，用革蘭氏染色法染色，在光學顯微鏡下觀察菌株形態。通過糖醇發酵、甲基紅（M.R）、乙酰甲基甲醇（V.P）、明膠液化、過氧化氫酶、纖維素分解、乙醇氧化、淀粉水解、七葉靈水解、尿素水解等試驗，研究篩選菌株的生理生化特征[5-7]。

1.3.2 菌株16S rDNA的序列分析 采用16S rDNA序列測定法，委托青島派森諾基因生物科技有限公司進行16S rDNA測序。將所得序列進行相似性比對分析，利用MEGA-X軟件生成系統發育樹[5]。

1.4 菌株生長曲線的測定

挑取篩選菌株單菌落，30℃、150 r/min于液體培養基中培養24 h，用無菌移液管分別吸取1 mL菌液接種至50 mL液體培養基中，并在相同條件下將菌液接種至含鉛200 mg/L的培養基中（設空白對照），30℃、150 r/min搖床培養，在96 h培養周期里，每2 h取樣1次。在8 000 r/min條件下離心5 min，沉淀的菌體用生理鹽水洗滌3次后，重新懸浮于生理鹽水中，在可見分光光度計下測定660 nm處菌體的OD值;上清液經稀釋、過濾后用電感耦合等離子光譜儀測定鉛濃度，以不接入菌體的空白含鉛培養基為對照組，計算鉛去除率[8]。

鉛去除率=×100%

1.5 不同因素對耐鉛菌株生長量和對Pb2+去除能力的研究

以溶液pH值、接種量和吸附溫度為單因素[9]，考察菌株在各條件下的生長情況和對鉛的去除效果。首先設定溶液pH值為5、6、7、8、9，鉛濃度為200 mg/L，接種量為5%，30℃、150 r/min搖床培養24 h，按照上述方法檢測菌體生長情況和對鉛的去除效果。然后依次確定接種量（2%、3%、5%、8%、10%）和培養溫度（20、25、30、35℃）的最佳值。

1.6 掃描電鏡分析

收集吸附鉛前后的菌樣，樣品經過固定、脫水、真空冷凍干燥等步驟，制備超薄菌株切片樣品，置掃描電鏡下觀察，對篩選菌株吸附鉛的機理進行初步分析[10]。

2 結果與分析

2.1 耐鉛菌株的篩選與鑒定

在不斷增加培養基的鉛濃度后，最終經過分離與篩選，得到了能在濃度為800 mg/L的含鉛培養基中生長的菌株，將其命名為J2。

2.1.1 菌株形態特征 形態學觀察發現，J2菌株呈黃色，菌株為圓形，表面隆起，有極生鞭毛，其菌落邊緣整齊、有粘性。

2.1.2 菌株生理生化結果 對J2菌株進行革蘭氏染色，結果表明其為革蘭氏陰性菌。J2菌株生理生化試驗結果如表1所示，J2菌株可利用葡萄糖、乳糖和蔗糖進行發酵，M.R和V.P試驗均呈陽性，可分解明膠、七葉靈和淀粉，不能分解纖維素和尿素，能分泌過氧化氫酶，不能氧化乙醇。

2.1.3 基于16S rDNA基因序列的菌株分子生物學鑒定 對J2菌株的16S rDNA進行擴增，用NCBI Blast程序將拼接后的序列文件與NCBI 16S數據庫中的數據進行比對，初步鑒定J2菌株為寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.），系統發育樹結果見圖1。

2.2 菌株的生長曲線測定

由圖2可知，J2菌株對鉛的吸附率隨著時間的延長、菌體數目的增加呈上升趨勢。接種0～5 h菌株處于生長調整期，5～36 h處于對數生長期，36 h后菌株開始進入穩定期，60 h后進入衰亡期。

J2菌株去除培養基中重金屬鉛的過程，主要表現為2個階段。第一個階段是在對數生長期和穩定期，去除率隨菌體數量的增加呈上升趨勢。當菌體生長進入穩定期末期和衰亡期時，鉛去除率變化進入第二階段，經過平臺期后，繼續持續增長。第一階段，J2菌株細胞表面的化學基團可以吸附重金屬鉛。這個過程不需要依靠微生物自身代謝，發生過程很迅速，因此表現為菌體數量和去除率變化保持同步。在第二階段菌體數量開始下降時，鉛去除率依然在上升，表明J2菌株還存在著對鉛的累積或轉化作用。這個過程J2菌株對鉛的去除表現為主動吸附，即將重金屬由表面轉移到內部的過程，該過程需要菌株細胞自身代謝產生的能量，因此這一過程需要一定時間[11]。

2.3 不同因素對耐鉛菌株生長量和對Pb 去除能力的研究結果

2.3.1 pH值 不同微生物對pH值的要求不同，由圖3可知，當pH值為9時，J2菌株生長情況最好且對鉛去除率最高。這可能是因為，隨著pH值的增加，菌體表面更多的負電官能團暴露于液體中，從而有更多的吸附位點吸附重金屬離子鉛。

2.3.2 接種量 由圖4可知，菌株對鉛的去除率隨著接種量的增加而增加，當接種量為5%，其去除率和菌株數目都達到最高。隨著接種量的增加，菌體表面對鉛的吸附位點也增加，因此鉛去除率提高;當培養

基一定時，隨著接種量繼續增大，培養基無法提供足夠的碳源和其他養分，導致耐鉛菌株數量減少。因此當接種量大于5%時，菌體對鉛去除率和菌體數目均呈下降趨勢。

2.3.3 溫 度 由圖5可知，在20～30℃范圍內，J2菌

株的生長情況和對鉛的去除率隨著溫度的升高而上升，當溫度為30℃時，J2菌株數目最多，鉛去除率最高。因為溫度的升高為菌株吸附鉛的過程提供了能量，故提高了菌株的鉛去除率。但當溫度超過30℃時，過高的溫度可能影響了菌體的正常代謝，對菌體細胞表面的官能團和重金屬的結合產生不利影響，因此J2菌株的生長量和鉛去除率都呈下降趨勢。

2.4 J2菌株掃描電鏡和能譜結果分析

為了研究J2菌株對鉛的去除機理，采用掃描電鏡對吸附鉛前后的菌體進行觀察，結果如圖6所示。從圖6A可以看出，J2菌株的菌體細胞呈直桿狀，形態飽滿、輪廓清晰，細胞表面平整，無粘附物。相對于空白組，吸附了鉛的菌體細胞表面粗糙，細胞形態發生干癟或扭曲變形，并且出現不規則聚集現象（圖6B）。這表明J2菌株存在著對鉛的表面吸附作用，所以細胞表面變粗糙。結合2.2中生長曲線的研究結果，初步推測J2菌株對鉛的去除機理包括表面吸附和胞內累積或轉化。

3 結 論

從某工廠處理水剩余污泥中分離篩選出一株耐鉛菌株J2，通過16S rDNA初步鑒定其為寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）。對J2菌株的耐受性和吸附能力進行檢測，發現J2菌株對重金屬鉛的最大耐受濃度為800 mg/L，在生長96 h之后對鉛的去除率可達76%。

研究不同pH值、接種量和溫度對J2菌株生長的影響，結果表明，J2菌株去除鉛的最佳pH值為9、最適接種量為5%、最適溫度為30℃。

根據J2菌株吸附鉛前后掃描電鏡結果，結合生長曲線分析，認為J2菌株對鉛的去除機理包括前期表面吸附和后期胞內累積或轉化2種形式。

試驗篩選的J2菌株對鉛的去除能力高，可豐富重金屬污染土壤微生物修復的生物資源，用于低質量濃度鉛污染土壤的生物修復。

參考文獻：

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（責任編輯：張煥裕）