HPLC法同時測定舒肝和胃丸中5種成分的含量

宮興華 鄭磊 李娟

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）14-1715-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.14.10

摘 要 目的：建立同時測定舒肝和胃丸中7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素、佛手柑內酯等5種成分含量的方法。方法：采用索氏提取法對舒肝和胃丸進行提取，經D101型大孔吸附樹脂分離后，采用高效液相色譜法測定上述5種成分的含量。色譜柱為Venusil MP C18，流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為270 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。結果：7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素、佛手柑內酯檢測質量濃度的線性范圍分別為1.875～187.5 μg/mL（r=0.999 9）、1.075～107.5 μg/mL（r=0.999 9）、1.261～126.1 μg/mL（r=0.999 9）、0.875～87.5 μg/mL（r=0.999 9）、2.033～203.3 μg/mL（r=0.999 8），精密度、穩定性（24 h）、重復性、耐用性試驗的RSD均小于2.0%，平均加樣回收率分別為95.18%～98.44%（RSD=1.27%，n=6）、95.35%～98.14%（RSD=1.16%，n=6）、95.21%～97.32%（RSD=0.83%，n=6）、95.43%～97.14%（RSD=0.76%，n=6）、95.12%～98.75%（RSD=1.35%，n=6）。3批舒肝和胃丸中上述5種成分的平均含量分別為0.424、0.239、0.305、0.180、0.459 mg/g（n=2）。結論：成功建立了可同時測定舒肝和胃丸中5種成分含量的方法。

關鍵詞 舒肝和胃丸;高效液相色譜法;含量測定;7-羥基香豆素;6，7-二甲氧基香豆素;5，7-二甲氧基香豆素;歐前胡素;佛手柑內酯

Simultaneous Determination of 5 Components in Shugan Hewei Pills by HPLC

GONG Xinghua1，ZHENG Lei1，LI Juan2（1. Dept. of Pharmacy， Shandong Provincial Third Hospital， Jinan 250031， China; 2. Dept. of Pharmacy， the Second Hospital of Shandong University， Jinan 250033， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of 7-hydroxycoumarin， 6，7-dimethoxy- coumarin， 5，7-dimethoxycoumarin， imperatorin and bergaptene in Shugan hewei pills. METHODS： Samples were extracted by Soxhlet extraction and separated by using D101 macroporous adsorption resin; HPLC method was used to determine the contents of above 5 components. The determination was performed on Venusil MP C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.1% phosphoric acid water solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 270 nm and the column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges were 1.875-187.5 μg/mL for 7-hydroxycoumarin （r=0.999 9）， 1.075-107.5 μg/mL for 6，7-dimethoxycoumarin （r=0.999 9）， 1.261-126.1 μg/mL for 5，7-dimethoxycoumarin （r=0.999 9）， 0.875-87.5 μg/mL for imperatorin （r=0.999 9）， 2.033-203.3 μg/mL for bergaptene （r=0.999 8）， respectively. RSDs of precision，stability （24 h）， reproducibility and durability tests were lower than 2.0%. Average recoveries were 95.18%-98.44% （RSD=1.27%，n=6）， 95.35%-98.14% （RSD=1.16%，n=6）， 95.21%-97.32% （RSD=0.83%，n=6）， 95.43%-97.14% （RSD=0.76%，n=6）， 95.12%-98.75% （RSD=1.35%， n=6）， respectively.? The average contents of the above five components in 3 batches of shugan hewei pills were 0.424， 0.239， 0.305， 0.180， 0.459 mg/g （n=2）.CONCLUSIONS： A method for simultaneous determination of five components in Shugan hewei pills was established.

KEYWORDS? ?Shugan hewei pills; HPLC; Content determination; 7-hydroxycoumarin; 6，7-dimethoxycoumarin; 5，7-dimethoxycoumarin; Imperatorin; Bergaptene

舒肝和胃丸由佛手、白芍、醋香附、陳皮、木香等13味中藥組成，具有舒肝解郁、和胃止痛的功效[1]，臨床用于治療肝胃不和、兩脅脹滿、胃脘疼痛、食欲不振、呃逆嘔吐及大便失調等癥[2]。該制劑的質量標準收載于2015年版《中國藥典》（一部），以芍藥苷作為含量測定指標[1]。然而，在舒肝和胃丸中，佛手的用量最大，達150 g，且為該方君藥，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰的作用[3-5]?？梢姡F行標準僅以芍藥苷作為舒肝和胃丸含量測定指標并不能有效控制組方中君藥佛手的質量，更不能有效控制該制劑的整體質量。經查閱相關的文獻資料發現，現有研究多以單一成分的含量作為舒肝和胃丸的質量控制指標[6-8];此外，單婷婷等[9]對舒肝和胃丸中揮發性成分進行了研究，也僅限于該類成分的指紋圖譜研究。鑒于此，本文以舒肝和胃丸中君藥佛手作為研究對象，擬建立同時測定該方中佛手活性成分7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素、佛手柑內酯含量的高效液相色譜法（HPLC），旨在為有效控制舒肝和胃丸的質量提供方法支持。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型HPLC儀，配有二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱溫箱（日本Shimadzu公司）;1200型HPLC儀（美國Agilent公司）;Meteler XP205型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度：0.01 mg）;KQ-600DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;A10型超純水機[密理博（中國）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

7-羥基香豆素對照品（批號：111739-200501，供含量測定用）、6，7-二甲氧基香豆素對照品（批號：111740- 200702，供含量測定用）、歐前胡素對照品（批號：110826-201918，純度：99.0%）、佛手柑內酯對照品（批號：520036-201401，純度：99.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院;5，7-二甲氧基香豆素對照品（北京北納創聯生物技術研究院，批號：A63874，純度：98.0%）;佛手（批號：190901）、白芍（批號：191212）、醋香附（批號：2001015）、陳皮（批號：200304）、木香（批號：190711）、郁金（批號：191203）、炒白術（批號：190808）、柴胡（批號：20100201）、廣藿香（批號：20191204）、炙甘草（批號：190811）、萊菔子（批號：20191113）、焦檳榔（批號：20190902）、烏藥（批號：200202）等中藥飲片均購自藥店，經山東省立第三醫院李俊峰副主任中藥師鑒定均為真品;舒肝和胃丸（北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，批號：18032500、19033869、19013386，規格：水蜜丸每100丸重20 g）;D101型大孔吸附樹脂（粒徑：0.25～0.84 mm，天津南大樹脂科技有限公司）;甲醇為色譜純，磷酸為優級純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～9 min，20%A;9～17 min，20%A→50%A;17～30 min，50%A→55%A;30～60 min，55%A→100%A）;流速：1.0 mL/min;檢測波長：270 nm;柱溫：30 ℃;進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液 取舒肝和胃丸適量，研碎，精密稱取粉末約2.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入甲醇100 mL，采用索氏提取法提取1 h，提取液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，通過D101型大孔吸附樹脂色譜柱（內徑1.5 cm，柱高10 cm），依次用水50 mL、30%甲醇50 mL、甲醇50 mL洗脫，收集甲醇洗脫液，旋轉蒸發至近干，用混合溶劑[甲醇-0.1%磷酸水溶液（20 ∶ 80，V/V），下同]轉移并定容至10 mL量瓶中，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取7-羥基香豆素對照品37.50 mg、6，7-二甲氧基香豆素對照品21.50 mg、5，7-二甲氧基香豆素對照品25.22 mg、歐前胡素對照品17.50 mg、佛手柑內酯對照品40.66 mg，分別置于20 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為各單一對照品貯備液。分別精密量取上述單一對照品貯備液各1 mL，置于同一20 mL量瓶中，用混合溶劑稀釋至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得上述成分質量濃度分別為93.75、53.75、63.05、43.75、101.65 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照舒肝和胃丸處方配比，稱取除佛手外的12味中藥飲片，按照“2.2.1”項下方法制備不含佛手的陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

分別取空白對照溶液（混合溶劑）、混合對照品溶液、供試品溶液（批號：18032500）和陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素、佛手柑內酯的色譜峰峰形對稱，其色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均不小于1.6，空白對照與陰性樣品溶液對5種成分的測定均無干擾，詳見圖1。

2.4 標準曲線繪制

取“2.2.2”項下單一對照品貯備液0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mL，分別置于100 mL量瓶中，用混合溶劑稀釋至刻度，搖勻，制成相應質量濃度的系列對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

2.5 精密度試驗

精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素和佛手柑內酯等5種成分峰面積的RSD分別為0.93%、1.17%、1.04%、0.88%、0.75%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取“2.2.1”項下供試品溶液（批號：18032500）適量，分別在室溫下放置0、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素和佛手柑內酯等5種成分峰面積的RSD分別為0.77%、1.24%、0.62%、1.43%、1.05%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.7? 重復性試驗

取同一批舒肝和胃丸（批號：18032500）適量，共6份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算含量。結果，7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素和佛手柑內酯等5種成分含量的RSD分別為1.42%、1.31%、1.27%、1.12%、1.05%（n=6），表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的舒肝和胃丸（批號：18032500）1.0 g，共6份，置于圓底燒瓶中，分別精密加入5種待測成分單一對照品貯備液240 μL，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.9 耐用性試驗

取同一批舒肝和胃丸（批號：18032500）適量，共3份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下，分別以不同儀器（Agilent 1200型和Shimadzu LC20A型HPLC儀）、色譜柱[Capcell pak C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]、檢測波長（268、270、272 nm）、柱溫（25、30、40℃）和流速（0.95、1.00、1.05 mL/min）進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算含量。結果，改變上述色譜條件后，5種成分的色譜峰分離度良好，含量的RSD均不大于1.5%（n=6或n=9），表明本方法的耐用性良好。

2.10 含量測定

取舒肝和胃丸3批，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，每批樣品平行測定2次，記錄峰面積并按標準曲線法計算含量。結果，3批舒肝和胃丸中，7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素、佛手柑內酯的平均含量分別為0.424、0.239、0.305、0.180、0.459 mg/g（n=2），詳見表3。

3 討論

3.1 待測成分的選擇

2015年版《中國藥典》（一部）在佛手藥材的“含量測定”項下，采用橙皮苷作為指標成分[1]。但是在舒肝和胃丸中除佛手外，陳皮中也含有大量的橙皮苷，因此橙皮苷不能準確地反映佛手的質量。本文旨在考察舒肝和胃丸中君藥佛手的質量，7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素、佛手柑內酯等5種成分均是佛手中的香豆素類活性成分，具有抗菌、抗腫瘤、抗凝血、松弛平滑肌等作用[4]。因此，本研究選擇上述5種特征性成分進行檢測，以期能更加準確地評價舒肝和胃丸中君藥佛手的質量。結果，3批舒肝和胃丸中這5種成分的平均含量分別為0.424、0.239、0.305、0.180、0.459 mg/g（n=2）。

3.2 色譜條件的選擇

首先，本課題組前期以甲醇-水作為流動相進行洗脫，結果待測成分色譜峰嚴重拖尾、峰形較差，佛手柑內酯峰與相鄰色譜峰的分離度很差?？紤]到待測成分具有一定的弱酸性，所以在水相中加入0.1%磷酸以改善色譜峰峰形，效果較好。其次，由于待測成分化學性質差別較大，在色譜柱上具有不同的保留行為，故本研究采用梯度洗脫的方式，并對梯度洗脫程序進行優化，以確保全部待測成分均實現基線分離。最后，考慮到5種待測成分具有不同的紫外吸收特征，本課題組前期采用二極管陣列檢測器，對5種待測成分的紫外吸收波長進行掃描，發現在270 nm波長處5種成分均具有較強的紫外吸收，故本研究選擇270 nm作為檢測波長。

3.3 提取方式的選擇

本課題組前期分別考察了索氏提取法、超聲提取法、加熱回流提取法提取舒肝和胃丸的效果。結果，超聲提取法和加熱回流提取法提取效率均略低于索氏提取法，且提取過程需要消耗大量的提取溶劑;索氏提取法采用少量的提取溶劑即可以將待測成分全部轉移到提取溶劑中，提取效率較高。因此，本研究采用索氏提取法進行樣品提取。舒肝和胃丸由13味中藥組成，所含有的成分非常復雜，尤其是水溶性糖類成分對分離效果的影響很大，并且還會嚴重縮短色譜柱的使用壽命。因此，為了減少其他成分對待測成分的干擾，本研究采用D101型大孔吸附樹脂對待測成分進行富集[10-14]，盡可能地去除其他成分，尤其是強極性的糖類成分。通過D101型大孔吸附樹脂分離以后，水溶性干擾成分明顯減少。

綜上所述，本研究以君藥佛手為研究對象，成功建立了同時測定舒肝和胃丸中7-羥基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、歐前胡素、佛手柑內酯等5種成分含量的HPLC法，可為舒肝和胃丸的質量控制提供方法支撐。

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（收稿日期：2020-04-09 修回日期：2020-06-03）

（編輯：鄒麗娟）