甘草對(duì)大鼠肺纖維化PDGF和TNF-α影響的研究*

劉新民 黃 晶 劉曉剛 趙中瑋

肺纖維化是一種慢性、進(jìn)行性疾病，能使患者呼吸功能逐漸惡化，肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡損傷，成纖維細(xì)胞增殖、大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積、肺組織修復(fù)、重塑，纖維結(jié)締組織異常增多的疾病。肺纖維化患者5年存活率只有20%[1]。簡(jiǎn)單的說(shuō)，就是肺臟組織逐漸發(fā)生纖維化，使得肺臟失去正常的呼吸功能，最終導(dǎo)致呼吸衰竭死亡，或有的死于肺栓塞或肺癌。

目前臨床上沒(méi)有很好的治療肺纖維化疾病的藥物，所以被稱(chēng)為“不是癌癥的癌癥”。而現(xiàn)在最可靠的方法就是肺臟移植，但是供體太少，無(wú)法滿(mǎn)足臨床患者的需要。因此我們探索用中醫(yī)中藥——甘草來(lái)治療肺纖維化疾病，為這一領(lǐng)域開(kāi)辟新的途徑。

中藥甘草，味甘性平，有祛痰止咳、補(bǔ)中益氣、清熱解毒、緩急止痛、調(diào)和藥性的作用，在中醫(yī)里面有“甘草解百毒”之說(shuō)，根據(jù)這一理論依據(jù)，我們選擇甘草作為研究對(duì)象，研究甘草在肺纖維化的表達(dá)中對(duì)PDGF以及TNF-α因子的影響，探索中藥甘草對(duì)肺臟纖維化的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組100只健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，在實(shí)驗(yàn)1周前購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)所，體質(zhì)量(180±20)g, 合格證號(hào)：scxk(甘2015-0001)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組)、模型組(B 組)、甘草干預(yù)組(C組)和地塞米松組(D組)，每組25只。

1.1.2 藥物博來(lái)霉素(1.25 ml/支，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20200829)、地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：171008)、 甘草流浸膏(500 ml/瓶，江西金芙蓉公司生產(chǎn)，批號(hào)：20190201)。

1.1.3 試劑及儀器腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒，武漢云克隆科技有限公司，批號(hào)：L181123449；血小板衍生生長(zhǎng)因子A(PDGFA)，武漢云克隆科技有限公司，批號(hào)：L181206525。酶標(biāo)儀采用上海安泰分析儀器有限公司生產(chǎn)的AT-858型自動(dòng)酶標(biāo)分析儀。

1.2 動(dòng)物模型的制備主要參考現(xiàn)有常用造模方法，選取腹腔注射博萊霉素，除正常對(duì)照組外，其余各組給予博來(lái)霉素6 mg/kg 每天腹腔注射，連續(xù)注射10 d。

1.3 給藥方法和途徑正常飲食，每周稱(chēng)體質(zhì)量。A組、B組在造模后當(dāng)天開(kāi)始每天灌胃生理鹽水；C組于造模前2 d開(kāi)始每天灌胃甘草流浸膏15 mg/kg；D組于造模后當(dāng)天即開(kāi)始每日灌胃地塞米松片0.5 mg/kg。A、B、C、D四組分別于造模后第3、7、14、28、42天隨機(jī)處死各5只。

1.4 標(biāo)本收集肺泡灌洗液的收集:將大鼠放血后，無(wú)菌條件下，固定大鼠，仰臥位，切開(kāi)頸部暴露并分離氣管,打開(kāi)胸腔，在環(huán)甲軟骨處切開(kāi)一小口，將一直徑約1 mm的塑料管插入，推進(jìn)約1. 5 cm到左主支氣管，用線結(jié)扎固定。然后將右主支氣管結(jié)扎。對(duì)左側(cè)肺臟進(jìn)行肺泡灌洗，方法是將3 ml生理鹽水注入抽吸3次，每次抽與吸約1 min,算作一次灌洗，這樣反復(fù)抽吸灌洗5次，將總量約15 ml肺泡灌洗液 (回收率均>85%) 集于同一離心管中。經(jīng)雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾后放至無(wú)菌離心管中進(jìn)行離心10 min，(4 ℃, 1000 r/min)，取上清液5 ml，放入20 ℃冰箱保存準(zhǔn)備待測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活率在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，未出現(xiàn)大鼠死亡，存活率100%。

2.2 肺泡灌洗液PDGF含量A組中，大鼠肺泡灌洗液中PDGF水平在各時(shí)間段沒(méi)有明顯變化，B組在第3天開(kāi)始升高,第14 d時(shí)達(dá)到高峰，高于A組(P<0.01),第28天呈下降趨勢(shì)，在第42天的水平仍高于A組(P<0.01)。經(jīng)地塞米松或甘草干預(yù)后，第3、7、14、28天時(shí)肺泡灌洗液中的PDGF的水平較B組明顯減低(P<0.05或P<0.01),但仍高于A組(P<0.05或P<0. 01)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠肺泡灌洗液中PDGF水平比較 (只,

2.3 泡灌洗液中TNF-α含量A組中，大鼠肺泡灌洗液中TNF-α水平在各時(shí)間段沒(méi)有明顯變化，B組在第3天開(kāi)始升高,第14天時(shí)達(dá)到高峰，高于A組(P<0.01),第28天呈下降趨勢(shì)，在第42天的水平仍高于A組(P<0.01)。經(jīng)甘草或地塞米松干預(yù)后，第3、7、4、28天時(shí)的水平較B組明顯減低(P<0.05或P<0.01),但仍高于A組(P<0.05或P<0. 01)。在后期,地塞米松或甘草對(duì)BALF中TNF-α水影響不明顯。見(jiàn)表2。

表2 各組時(shí)間點(diǎn)大鼠肺泡灌洗液中TNF-α水平 (只,

3 討論

甘草,氣味微甜。有清熱解毒、祛痰止咳、補(bǔ)中益氣、緩急止痛，調(diào)和藥性的功效，在中醫(yī)理論中有甘草解百毒之說(shuō)。如果將肺纖維化理解為中醫(yī)的“疫毒”造成的結(jié)果，那么用甘草來(lái)研究治療肺纖維化也符合這一理論。而現(xiàn)代藥理學(xué)研究甘草具有抗腫瘤、抗凝血、抗血栓、抗氧化、抗前列腺炎、抗病原微生物酶抑制作用[2]。楊豆等[3]研究還有抗癌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)作用,而對(duì)于肺臟纖維化的研究報(bào)道比較少。

肺纖維化發(fā)生的機(jī)制，目前沒(méi)有明確研究清楚，但根據(jù)最新研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)其發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，與許多細(xì)胞因子有關(guān)。如TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13等，TGF-β、PDGF等廣泛認(rèn)為參與了肺纖維化的發(fā)病機(jī)制[4]。

TNF-α可以通過(guò)促進(jìn)肺泡Ⅱ細(xì)胞的凋亡[5，6]抑制肺組織損傷修復(fù)過(guò)程。并且可以募集中性粒細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。因此，TNF-α在肺間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制中起重要作用。在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，內(nèi)源性的TNF-α過(guò)量表達(dá)能促進(jìn)肺纖維化; TNF-α 是臨床檢驗(yàn)肺纖維化的一個(gè)重要指標(biāo)[7]。

PDGF是刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的主要致分裂原，對(duì)成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞有趨化作用，可刺激成纖維細(xì)胞增殖，參與肺纖維化形成過(guò)程[8-10]。

而PDGF, IL-17均與組織損傷、上皮損害、間質(zhì)細(xì)胞損傷、炎癥損傷關(guān)系密切。徐林等[11]發(fā)現(xiàn)，人體中PDGF 與疾病的嚴(yán)重程度關(guān)系密切，值越低，提示病情輕微，轉(zhuǎn)歸容易。若PDGF 值越高，則病情越重，肺纖維化越嚴(yán)重。TNF-α和PDGF是導(dǎo)致肺纖維比較關(guān)鍵的細(xì)胞因子[12-14]?？梢?jiàn)，TNF-α及PDGF在肺纖維化中有著重要的作用，因此很多研究者觀察纖維化時(shí)都把這兩個(gè)指標(biāo)作為肺纖維化研究的指標(biāo)。

本研究通過(guò)甘草對(duì)肺纖維化大鼠肺泡灌洗液干預(yù)的實(shí)驗(yàn)，觀察到，生理狀態(tài)下，大鼠PDGF和TNF-α的表達(dá)在各個(gè)時(shí)間段上變化不大，造模后14天這兩個(gè)值含量都達(dá)到了峰值，以后逐漸降低，第42天降低更明顯，但仍然高于正常對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘草在各時(shí)間點(diǎn)上均能夠有效降低肺泡灌洗液中PDGF和TNF-α的水平，對(duì)博萊霉素所誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化具有防治作用，能抑制或延緩博萊霉素導(dǎo)致大鼠肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程，為以后肺纖維化疾病的防治提供了新的途徑。