不同樣本類型對EBV DNA檢測結果的影響

蘇 曦， 周 琰， 沈敏娜， 李懿皞， 王蓓麗， 潘柏申， 郭 瑋

（復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032）

EB病毒（Epstein-barr virus，EBV）是一種感染性疾病的常見病原體，與傳染性單核細胞增多癥、鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等密切相關[1]。目前，臨床實驗室檢測EBV DNA的樣本類型主要為血漿和外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。有研究結果顯示，不同樣本類型之間EBV DNA檢測結果會有差異[2]。為此，本研究擬通過比較不同疾病患者不同樣本類型之間EBV DNA檢測結果的差異，為不同疾病患者樣本的選擇提供依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年1—12月復旦大學附屬中山醫院進行EBV DNA檢測的患者2 694例，其中男1 639例、女1 055例，年齡12～90歲；確診鼻咽癌84例、霍奇金淋巴瘤119例、非霍奇金淋巴瘤466例。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理 采集所有對象靜脈血6 mL，乙二胺四乙酸抗凝。采用梯度密度離心法提取PBMC，Ficoll分離液購自瑞典GE Healthcare公司，棄上清，留沉淀備用。將剩余血樣950×g離心10 min，分離血漿，吸取100 μL血漿至Eppendorf管中，與等量DNA濃縮液充分混勻，17 950×g離心10 min，棄上清，留沉淀備用。PBMC及血漿EBV DNA提取：向含有PBMC及血漿沉淀的Eppendorf管中各加入核酸裂解液50 μL，充分混勻后100 ℃孵育10 min，15 300×g離心5 min后備用。

1.2.2 熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR） EBV DNA熒光定量PCR試劑購自中山大學達安基因股份有限公司，檢測儀器為LightCycler 480 PCR擴增儀（瑞士羅氏公司）。反應體系：PCR反應液40 μL、Tap酶3 μL，模版2 μL。擴增條件：93 ℃ 2 min；93 ℃ 20 s，57 ℃45 s，共40個循環；40 ℃ 10 s。每次檢測均設陰性和陽性質控，分別以陽性定量參考品104、105、106、107拷貝/mL繪制標準曲線，并進行標準曲線的相關分析與回歸分析。結果判定：檢測到核酸擴增且增長曲線呈S型判定為檢出EBV DNA（陽性），無擴增曲線判定為陰性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。將EBV DNA拷貝數進行對數轉換。2種樣本之間的一致性比較采用Kappa一致性檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PBMC和血漿EBV DNA的檢測結果

2 694例樣本中，PBMC EBV DNA和血漿EBV DNA均陽性的樣本為131例（4.86%），血漿EBV DNA陰性而PBMC EBV DNA陽性的樣本為1 045例（38.79%），血漿EBV DNA陽性而PBMC EBV DNA陰性的樣本為3例（0.11%），血漿EBV DNA和PBMC EBV DNA均陰性的樣本為1 515例（56.24%）。一致性檢驗結果顯示，2種樣本檢測結果的一致性較低（Kappa＜0.4）。

在血漿和PBMC雙陽性的131例樣本中，PBMC EBV DNA拷貝數高于血漿EBV DNA拷貝數（Kappa=0.122，P＜0.001）。見圖1。

圖1 PBMC與血漿EBV DNA拷貝數的比較

2.2 鼻咽癌患者PBMC和血漿EBV DNA檢測結果的比較

84例鼻咽癌患者中有24例（28.57%）PBMC EBV DNA陽性，血漿EBV DNA均為陰性。PBMC EBV DNA拷貝數明顯高于血漿EBV DNA拷貝數（kappa=0.444，P＜0.001）。見圖2。

2.3 霍奇金淋巴瘤患者PBMC和血漿EBV DNA檢測結果的比較

1 1 9例霍奇金淋巴瘤患者中有4 5例（37.82%）PBMC EBV DNA陽性，有6例（5.04%）PBMC和血漿EBV DNA均陽性，有39例（32.77%）血漿EBV DNA陰性而PBMC EBV DNA陽性，有74例（62.18%）PBMC和血漿EBV DNA均陰性。PBMC EBV DNA拷貝數高于血漿EBV DNA拷貝數（Kappa=0.161，P＜0.001）。見圖3。

圖2 鼻咽癌患者PBMC與血漿EBV DNA拷貝數的比較

圖3 霍奇金淋巴瘤患者PBMC與血漿EBV DNA拷貝數的比較

2.4 非霍奇金淋巴瘤患者PBMC和血漿EBV DNA檢測結果的比較

4 6 6例非霍奇金淋巴瘤患者有1 9 3例（41.42%）PBMC EBV DNA陽性，有24例（5.15%）PBMC和血漿EBV DNA均陽性，有169例（36.27%）血漿EBV DNA陰性而PBMC EBV DNA陽性，有273例（58.58%）PBMC和血漿EBV DNA均陰性。PBMC EBV DNA拷貝數明顯高于血漿EBV DNA拷貝數（Kappa=0.143，P＜0.001）。見圖4。

圖4 非霍奇金淋巴瘤患者PBMC與血漿EBV DNA拷貝數的比較

3 討論

目前，檢測EBV的方法主要為病毒的分離和鑒定、病毒抗原檢測、血清學檢測以及分子生物學方法等。隨著檢測技術的進步，分子診斷成為EBV檢測的主要方法。與其他檢測技術相比，PCR具有敏感性高、特異性好等優點，有助于疾病的早期發現、早期治療及療效監測。檢測EBV DNA的樣本主要為PBMC和血漿，但提取PBMC步驟繁瑣，手工操作較多，易影響檢測結果。

本研究結果顯示，PBMC EBV DNA和血漿EBV DNA檢測結果的一致性差（Kappa＜0.4）。外周血中的EBV DNA一般是以溶解的線型DNA或環狀DNA形式游離存在，血漿中的EBV載量遠低于PBMC。因此，不建議以血漿完全替代PBMC進行EBV DNA檢測。

EBV DNA陽性是EBV存在的直接證據。EBV在感染細胞內主要有2種存在形式：增殖性感染和潛伏性感染[3]。由于存在潛伏感染，因此在正常人PBMC中也可能有低拷貝的EBV DNA被檢出，但通常低于實驗室陽性報告范圍。EBV感染人體后便進入增殖期，病毒在淋巴細胞中大量增殖并釋放入血漿或淋巴液中，此時在患者PBMC或血漿中可檢測到高拷貝的EBV DNA。因此PBMC中的EBV DNA拷貝數一般遠高于血漿。在病毒潛伏階段，對PBMC中的EBV DNA進行檢測，可對疾病進行早期診斷或進行療效監測。而在病毒增殖階段，EBV在PBMC中大量增殖，導致細胞破裂、溶解，病毒大量釋放入血，此時檢測血漿中的EBV DNA價值更大。

另外，本研究還回顧分析了患者的病史資料，比較了鼻咽癌患者、霍奇金淋巴瘤患者和非霍奇金淋巴瘤患者PBMC和血漿樣本中EBV DNA的陽性率。結果顯示，不同疾病患者PBMC與血漿樣本中EBV DNA的陽性率和拷貝數均有差異。

有學者認為鼻咽癌患者首推的樣本類型是血漿[4]。還有學者認為鼻咽癌患者血漿和PBMC的EBV DNA檢測結果有很好的一致性[5]。本研究結果顯示，在24例EBV DNA陽性的鼻咽癌患者中，PBMC EBV DNA陽性率及拷貝數均高于血漿（P＜0.001）。原因可能與本研究的鼻咽癌患者絕大部分處于放療治療中或治療后有關。FAN等[6]發現，在鼻咽癌緩解期患者的血漿中很難檢測到EBV DNA，鼻咽癌患者血漿中的EBV DNA拷貝數可能與疾病進程及治療程度有關。本研究未按疾病進程對鼻咽癌患者再進行分組統計，這可能是血漿EBV DNA陽性率及拷貝數低于PBMC的原因。

本研究結果顯示，在霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤中，PBMC EBV DNA陽性率及拷貝數均高于血漿（P＜0.001），這與朱耀武等[7]的研究結果一致，但陽性率低于陸海英等[8]的報道。由此可見，對于EBV感染患者，檢測PBMC EBV DNA的敏感性高于血漿，可用于臨床治療后的動態監測。本研究EBV DNA陽性率低于文獻報道[8]，可能與本研究入組的淋巴瘤患者，未按疾病治療進程進行分組有關。對于需進行動態監測的患者，可以通過設定臨界值來判斷病毒感染處于潛伏期還是活動期。

綜上所述，由于PBMC EBV DNA陽性率和拷貝數均高于血漿，且EBV DNA拷貝數與患者是否需接受治療密切相關。因此，對于EBV感染的診斷和監測，實驗室工作人員應與臨床溝通，結合疾病類型選用合適的樣本類型。