3D數字PCR檢測NSCLC患者血漿EGFR T790M基因突變的臨床意義

袁世洋， 劉 川， 歐陽曉春， 謝軍平， 賀榮芝， 李里香， 鄒葉青

（1.福建醫科大學附屬南平第一醫院重癥醫學科，福建 南平 353000；2.南昌大學第二附屬醫院江西省分子醫學重點實驗室，江西 南昌 330006；3.中國人民解放軍聯勤保障部隊第908醫院神經內科，江西 南昌 330009；4.南昌大學第二附屬醫院病理科，江西 南昌 330006）

最新全球癌癥統計數據顯示，肺癌占癌癥發生率和死亡率的首位，分別為11.6%和18.4%[1]。肺癌按組織學分型可分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC占原發型肺癌的80%～85%[2]。近年來，針對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因分子靶向治療的快速發展雖然給具有EGFR敏感突變的NSCLC患者帶來了福音，但是腫瘤治療的耐受問題卻不可避免。目前研究結果顯示，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）獲得性耐藥機制中約60%由EGFRT790M突變引起[3]，而奧希替尼能使這類患者明顯獲益[4]。由此可見，在NSCLC患者接受EGFR-TKI靶向治療的過程中，監管EGFRT790M突變對及時應用奧希替尼治療是非常必要的。“液體活檢”技術近年來倍受推崇，其中循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）作為“液體活檢”技術的“三駕馬車”之一，更受研究者關注。有研究結果顯示，晚期NSCLC患者血漿ctDNA中存在EGFRT790M突變，并能受益于奧希替尼治療[5]。但血漿ctDNA的分子片段小、豐度低等特性給基因檢測在臨床中的應用帶來了挑戰[6]。本研究所采用的3D數字聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是在數字PCR的基礎上，將混有樣品和探針的PCR反應體系均勻分散至1張含有2萬個ctDNA微孔的芯片上，形成2萬個相互獨立的微反應體系，每個微孔進行獨立的PCR擴增，根據泊松分布的數學模型計算目標片段拷貝數。本研究以擴增阻滯突變系統（amplification refractory mutation system，ARMS）作為參考標準，評價3D數字PCR檢測血漿EGFRT790M基因突變的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集2017年10月—2018年8月南昌大學第二附屬醫院分子醫學重點實驗室被檢測為初代EGFR-TKI耐藥的70例NSCLC患者作血液標本及臨床資料，編號后由2位實驗人員分別采用ARMS和3D數字PCR對上述標本進行EGFRT790M基因突變檢測。對于檢測結果不一致的患者，及時反饋給臨床醫生，盡可能獲取患者腫瘤組織標本進行驗證。本研究經南昌大學第二附屬醫院倫理委員會批準，且患者知情同意。

1.2 儀器與試劑

7500 Real Time PCR Systerm、Proflex 2×Flat PCR System、3D數字PCR芯片閱讀儀和3D數字PCR芯片裝載儀購自美國Life Technologies公司；Qubit 3.0熒光計、ST16R臺式高速離心機、臺式低速離心機等購自美國Thermo Fisher公司。人EGFR基因突變檢測試劑盒、石蠟組織切片DNA提取試劑盒購自廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司；人EGFR基因T790M突變檢測試劑盒、磁珠法核酸提取血漿游離DNA提取試劑盒購自天津諾禾致源科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血漿標本ctDNA提取 使用2支乙二胺四乙酸抗凝采血管，采集不少于15 mL全血，1 600×g離心10 min取上清，將取得的上清液于4 ℃、16 000×g離心10 min。把離心后的血漿分裝到15 mL離心管中，加入20%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和蛋白酶K，混勻后于60 ℃孵育20 min。準備新的15 mL離心管，依次加入ctDNA結合液及ctDNA捕獲磁珠，將孵育后的血漿置于冰上5 min，再將血漿加入剛準備好的離心管中，充分混勻。將離心管置于15 mL磁力架上5 min，直至磁珠完全被磁力吸附到同一側，小心移出上清液，加入ctDNA漂洗液漂洗2次，80%乙醇漂洗2次，最后用50 μL ctDNA洗脫液洗脫，磁力架吸附后吸取上清，即為ctDNA。使用Qubit 3.0熒光計測定所提取ctDNA的濃度，并于-20 ℃保存備用。

1.3.2 腫瘤組織標本DNA提取 切取5～8片5 μm厚度的腫瘤組織放入1.5 mL離心管內，經脫蠟、脫苯處理后，使用石蠟組織切片DNA提取試劑盒提取DNA。使用Qubit 3.0熒光計測定所提取的DNA濃度，并于-20 ℃保存備用。

1.3.3 檢測血漿EGFRT790M突變 （1）ARMSEGFR突變檢測：使用人EGFR基因突變檢測試劑盒進行檢測，具體操作按說明書進行；（2）3D數字PCR血漿EGFRT790M突變檢測：樣本稀釋后取30 ng ctDNA原液，加入去離子水至體積為6.75 μL，加入T790M-M1 7.5 μL、T790M-M2 0.75 μL，使終體積為15 μL，微離心后充分混勻，用3D數字PCR芯片裝載儀上樣14.5 μL。PCR擴增程序：96 ℃ 10 min；62 ℃ 2 min，98 ℃ 30 s，39個循環；10 ℃保持。用3D數字PCR芯片閱讀儀讀取芯片，并采用分析軟件進行結果分析。

1.3.4 結果判讀 ARMS檢測結果的判讀根據說明書進行（圖1）。3D數字PCR檢測結果的判讀依據配套軟件進行自動分析，即自動分析每個樣本每個微滴的FAM和VIC的熒光信號，根據陽性微滴的比例自動獲得PCR反應體系中起始模板DNA拷貝數濃度，并給出突變百分比，當突變百分比≥0.1時顯示陽性（圖2）。

圖1 ARMS檢測血漿EGFR T790M突變

圖2 3D數字PCR檢測血漿EGFR T790M突變

1.4 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行統計分析，采用Kappa一致性檢驗和配對χ2檢驗比較ARMS和3D數字PCR檢測患者血漿EGFRT790M結果的一致性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般臨床特征

70例NSCLC患者中，男28例、女42例，年齡43～83歲，中位年齡62歲。所有患者均為晚期NSCLC，其中61（87.1%）例為腺癌。所有患者均接受EGFR-TKI靶向治療，其中有58（82.9%）例選擇了吉非替尼治療。既往EGFR突變狀態：41（58.6%）例為19-Del，27（38.6%）例為L858R突變。使用EGFRTKI靶向治療后（檢測時已明確腫瘤進展），EGFRT790M總突變率為48.6%，其中男性患者的EGFRT790M突變率為53.6%，女性患者為45.2%。見表1。

表1 患者一般臨床特征 例（%）

2.2 3D數字PCR和ARMS檢測血漿EGFR T790M基因突變結果比較

為了解3D數字PCR檢測NSCLC患者血漿EGFRT790M突變的臨床價值，我們把同一份血漿標本提取的ctDNA平均分為3份：1份用3D數字PCR檢測；1份采用ARMS檢測，并且將所得結果作為參考標準；另1份保存在-80℃冰箱用于復檢。對2種方法檢測結果不同的標本，及時反饋給臨床醫生，獲取腫瘤組織標本進行驗證。70份血漿標本中，ARMS檢出T790M突變30（42.9%）例，3D數字PCR檢出34（48.6%）例（表2）。采用Kappa一致性檢驗比較這2種方法檢測患者血漿EGFRT790M突變結果的一致性，結果顯示Kappa值為0.885（P＜0.001），表示2種方法診斷結果一致性良好。

表2 3D數字PCR和ARMS檢測NSCLC患者血漿EGFR T790M突變的比較 例

有4例血液標本2種方法的檢測結果不同，且ARMS檢測結果均為EGFRT790M野生型。這4例患者中有3例進行了再次組織活檢檢測，1例拒絕。復檢結果顯示，ARMS檢測這3例均為EGFRT790M突變。這些結果表明，3D數字PCR和ARMS一樣可用于檢測NSCLC患者血漿EGFRT790M突變，并且3D數字PCR還可以檢測出ARMS所漏檢的EGFRT790M突變患者。

3 討論

EGFR基因是NSCLC的一個非常重要的驅動基因，基于EGFR突變機制及藥物研究的快速發展，NSCLC的治療方式發生了巨大轉變。EGFR突變的NSCLC患者初代EGFR-TKI療效顯著，但仍在9～13月內不可避免地產生耐藥[7]。目前已有研究報道了初代EGFR-TKI的眾多獲得性耐藥機制，如EGFRT790M突變、MET基因擴增、ERBB2基因擴增、肝細胞生長因子過表達、PTEN基因失活等[8-9]，其中約有60%的EGFR-TKI的獲得性耐藥是由EGFRT790M突變引起的[3]。

目前，一般通過定期的胸部電子計算機斷層掃描等影像學復查評價腫瘤治療的有效性，但有研究結果顯示，在疾病進展早期就可以在外周血中檢測到EGFRT790M突變[10]。因此，在EGFR-TKI治療過程中通過檢測血液EGFRT790M突變對早期發現因EGFRT790M突變引起的耐藥性也有著積極的臨床意義。另一方面，血液標本比腫瘤組織樣本采集更簡便，且無創，患者的依從性更佳。

目前，已有多種半定量和定量基因分析平臺被開發用于血漿EGFR基因分型檢測，包括AMRS[11]、微滴數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）[12]以及下一代測序（next-generation gene sequencing，NGS）[13]等。ZHANG等[14]從311個研究中篩選出11個血漿EGFR基因檢測法納入系統進行分析，發現數字PCR檢測ctDNAEGFRT790M突變的敏感性和特異性分別為70.1%和86.9%。THRESS等[15]使用4種方法（包括2種非數字法和2種數字法）檢測血漿ctDNAEGFR突變，結果表明數字方法檢測EGFRT790M突變具有更好的敏感性。

采用Kappa一致性檢驗比較ARMS和3D數字PCR檢測患者血漿EGFRT790M突變結果的一致性，發現2種方法的一致性良好。此外，本研究對ARMS檢測EGFRT790M為野生型而3D數字PCR檢測EGFRT790M突變的4例患者中的3例再次進行腫瘤組織標本檢測，結果證實此3例均為EGFRT790M突變表明3D數字PCR在具有較高敏感性的同時，也顯示出了較好的特異性，可以檢測出ARMS所漏檢的EGFRT790M突變患者。這一觀點與FENG等[16]的研究結果一致。

本研究尚存在一些不足之處：首先，我們并未對所有患者的腫瘤組織樣本進行EGFRT790M突變檢測，以更好地對ARMS和3D數字PCR檢測血漿EGFRT790M突變的敏感性和特異性進行比較；其次，納入的樣本量相對較小，仍需要更大樣本量的臨床研究進行驗證。總而言之，本研究認為3D數字PCR是一種高敏感性和特異性的新方法，適用于檢測NSCLC患者血漿EGFRT790M基因突變。