血清醛固酮候選參考測量程序的建立及性能評估

鄒繼華， 李全樂， 沈 敏， 張 曼， 楊曉東， 屠敏敏， 馮東方， 孫宏娜

（1. 美康生物參考實驗室，浙江 寧波 315104；2. 首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院檢驗科，北京 100038；3. 西藏軍區總醫院檢驗科，西藏 拉薩 850007）

醛固酮是人體內調節血容量的激素，通過調節腎臟對鈉離子的重吸收，維持水鹽平衡[1]。準確測定血清醛固酮對于原發性醛固酮增多癥（primary aldosteronism，PA）的篩查、診斷和亞型評估至關重要[2]，血清醛固酮還可用于診斷腎上腺偶發瘤、腎上腺癌、艾迪生病、先天性腎上腺增生、腎臟動脈狹窄和腎小管通道病變[3]。因此，準確測定血清醛固酮水平對于正確診斷內分泌疾病至關重要。血清醛固酮水平一般為pmol級別，對檢測方法的準確度和靈敏度有很高的要求。目前用于醛固酮測定的放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）和化學發光免疫分析法存在缺乏特異性、基質效應及分析物動態范圍有限等問題[4-5]。因此，需要一種更加靈敏、準確的方法來獲得可靠的檢測結果。氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）[6]和液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[7]是目前靈敏度和準確性最好的方法。在測定類固醇激素時，GC-MS的樣本前處理需要進行復雜的衍生化，而LC-MS/MS的前處理步驟更加簡便，耗時短，靈敏度高，更能滿足臨床需求。目前，檢驗醫學溯源性聯合委員會（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）列出了2種血清醛固酮參考方法[6，8]，分別由德國臨床化學學會和比利時根特大學建立，均采用GC-MS，以同位素稀釋質譜法為測量原理，樣本前處理時需要衍生化，操作繁瑣，分析時間長。本研究擬采用同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法（isotope dilution liquid chromatographytandem mass spectrometry，ID-LC-MS/MS），以液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）方式進行樣本前處理，建立測定血清醛固酮的候選參考方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX QTRAP 5500液相色譜串聯質譜（美國SCIEX公司）、Thermo Hypersil BDS C18柱（100 mm×2.1 mm，粒徑2.4 μm，美國Thermo Fisher Scientific公司）、XS 205DU型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）、Eppendorf移液器（德國Eppendorf AG公司）、Milli-Q超純水系統（德國Millipore公司）。

醛固酮標準品[純度≥99%，濃度為（106.4±0.1）μg/mL]和內標醛固酮-2H7[純度≥98.85%，濃度為（102.9±0.1）μg/mL，同位素豐度為98%]均購自美國Iso Sciences公司。無水乙醇、甲基叔丁基醚、甲醇均為色譜級，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 標準品制備 采用重量法配制醛固酮和醛固酮-2H7標準溶液，用乙醇稀釋，分別制備成674.77 ng/g醛固酮標準儲備液和653.63 ng/g醛固酮-2H7儲備液。進一步用乙醇稀釋醛固酮標準儲備液，分別制備出濃度為1.345 26 ng/g的醛固酮標準工作液1，濃度為0.363 85 ng/g的醛固酮標準工作液2以及濃度為0.758 16 ng/g的醛固酮-2H7工作液。配制的溶液-20 ℃密封避光保存。

1.2.2 樣本前處理 移取0.25 mL內標工作液至5 mL離心管并用天平稱重，加入血清之前將溶劑吹干以避免蛋白沉淀。準確稱取0.5 mL血清樣本，加入已吹干的5 mL離心管中。樣本和內標在室溫條件下溫和振蕩平衡10 min。然后加入2.5 mL甲基叔丁基醚，振蕩10 min，2 560×g離心3 min后吸取上清液至新的5 mL離心管中。將萃取物在35 ℃條件下用氮氣吹干，再加入200 μL 30%（V∶V）甲醇水溶液復溶，混勻，13 000×g離心5 min，取150 μL上清，加入進樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱為Thermo Hypersil BDS C18柱，流動相A為甲醇，流動相B為純水，流速為0.3 mL/min，柱溫為40℃，進樣體積為10μL。梯度洗脫（0→4 min，30%A→60%A；4→4.1 min，60%A→95%A；4.1→5 min，95%A；5→5.1min，95%A→30%A；5.1→7 min，30%A）。

1.2.4 質譜分析條件 采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）負離子模式，離子化電壓-4 500 V，霧化溫度550 ℃，霧化氣、輔助加熱氣和氣簾氣分別為40、55、15 psi。采用多反應監測模式掃描分析。見表1。

1.3 方法性能評估

1.3.1 標準曲線與線性評價 采用重量法通過向內標工作液添加不同質量的標準工作液制作9點標準曲線，使得標準與內標的質量比值范圍為0.1～4.5，醛固酮的濃度范圍為0.08～3.55 nmol/L。將標準和內標混合溶液在35 ℃條件下用氮氣吹干，再加入200 μL 30%（V∶V）甲醇水溶液復溶，混勻，轉移到進樣瓶中用于LC/MS/MS分析。每個濃度樣本測定2次，取均值。各濃度的檢測偏移＜15%，且r＞0.99可判斷為呈線性[9]。

1.3.2 干擾評價 將16種與醛固酮結構類似的類固醇激素作為潛在干擾物進行評價。用50%（V∶V）甲醇水溶液配制高于正常生理濃度的類固醇激素溶液（濃度為500 nmol/L的皮質酮、皮質醇、睪酮、硫酸脫氫表雄酮、脫氫表雄酮、雌二醇、孕酮、可的松、17-羥孕酮、17-羥孕烯醇酮、11-脫氧皮質醇、21-脫氧皮質醇、11-脫氧皮質酮、雌酮、雙氫睪酮和雄烯二酮），并采用ID-LC-MS/MS檢測。若醛固酮保留時間（4.19 min）無色譜峰，則這些結構類似物對血清醛固酮定量不存在干擾。另外，為了評估其他潛在干擾，通過比較標準溶液和90份血清樣本中醛固酮定性離子/定量離子（confirmation ion to quantitation ion，CI/QI）比值的平均值，若差異＜20%可判斷為不存在影響血清醛固酮定量檢測的潛在干擾[10]。

1.3.3 檢測限與定量限（limit of quantitation，LOQ） 用已知濃度的血清樣本（0.225 nmol/L）稀釋得到3個濃度梯度的樣本（編號為1、2、3），即預期LOQ限樣本，分別計算每個濃度樣本的濃度測定均值與理論濃度的偏差及精密度。LOQ要滿足偏移＜20%、變異系數（coefficient of variation，CV）＜20%、信噪比（signal-to-noise ratio，RSN）≥10，以RSN=3時的計算濃度值為檢測限[9]。

1.3.4 精密度評價 測定3個批次低濃度（0.208 nmol/L）、中濃度（1.295 nmol/L）、高濃度（2.880 nmol/L）血清醛固酮，每個濃度樣本重復測定5次，分別計算批內CV和批間CV。

1.3.5 準確度評價 通過加標回收和室間比對研究2種方式對方法的準確度進行評價。（1）加標回收實驗：分別稱量濃度為6.747 7 ng/g的醛固酮標準溶液0.05、0.25、0.5 mL，氮氣吹干后分別加入已知濃度（0.362 nmol/L）的混合血清（B），采用重量法各加入3.5 mL，混勻，制備出3個濃度的加標樣本，分別計算添加理論濃度（C），然后將各個濃度的加標樣本（各6份）進行處理后進樣檢測，得到實際測定濃度（A），加標回收率（R）=（A-B）/C×100%。回收率應滿足100%±10%。（2）室間比對研究：采用建立的ID-LC-MS/MS測定國際臨床化學和檢驗醫學聯合會參考實驗室外部質量評價計劃（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine External Quality Assessment Scheme for Reference Laboratories in Laboratory Medicine，RELA）樣本，對每個批次3份樣本進行前處理，連續測定2個批次，將測量結果與RELA回報結果作偏移比較，偏移在±8.75%判斷為可接受。

1.3.6 基質效應 采用基質混合實驗的方法來評價相對基質效應，通過檢測血清基質樣本（A）、溶液基質標準溶液（B）、血清和溶液50∶50（質量比）混合物（C）、血清和溶液80∶20（質量比）混合物（D）、血清和溶液20∶80（質量比）混合物（E）這5種基質樣本中標準與內標的峰面積比值來計算相對基質效應。1∶1混合物相對基質效應=[C-（A+B）/2]/[（A+B）/2]×100%；80∶20混合物的相對基質效應=[D-（0.8A+0.2B）]/（0.8A+0.2B）×100%；20∶80混合物的相對基質效應=[E-（0.2A+0.8B）]/（0.2A+0.8B）×100%。如果3種混合物計算得到的結果＜20%，則視為無相對基質效應[11-12]。

1.4 不確定度評估

依據《測量不確定度表示指南》（Guide to the Uncertainty in Measurement，簡稱GUM），測量結果的濃度計算公式為C=（A/A內標-b）/k×fc×fm，式中C為醛固酮的測定值（ng/mL）、A/A內標為樣本與內標的峰面積比值、b為標準曲線截距、k為標準曲線斜率、fc為標準與內標溶液濃度修正因子、fm為樣本處理修正因子。從標準工作液配制、樣本處理、儀器檢測及重復測量4個方面分析不確定度來源，并量化各個分量[9]。

2 結果

2.1 標準曲線和線性評價

純溶液和血清樣本中醛固酮標準和內標的色譜圖見圖1。標準曲線見圖2，醛固酮在0.08～3.55 nmol/L范圍內呈線性。

圖1 醛固酮和醛固酮-2H7的色譜圖

圖2 ID-LC-MS/MS檢測血清醛固酮的標準曲線

2.2 干擾評價

在醛固酮的檢測條件下，16種類固醇激素在醛固酮保留時間（4.19 min）無干擾峰，在4.54 min出峰也能與醛固酮的峰基線分離，表明16種類固醇激素對血清醛固酮定量檢測不存在干擾，見圖3。標準溶液和血清樣本中醛固酮CI/QI比值的平均值分別為0.71和0.69，偏移為2.3%，表明該方法不存在影響血清醛固酮定量的潛在干擾。見表2。

圖3 類固醇激素和醛固酮標準的色譜圖

表2 標準溶液和血清樣本中CI/QI比值

2.3 LOQ和檢出限

血清醛固酮的LOQ為0.045 nmol/L，檢測限為0.012 nmol/L。見表3。

2.4 精密度評價

血清醛固酮低、中、高濃度的批內、批間CV分別為＜5.0%和＜4.1%，見表4。

表3 醛固酮的LOQ評估結果

表4 醛固酮的精密度評價結果

2.5 準確度評價

2.5.1 加標回收實驗 血清醛固酮加標樣本平均回收率為98.52%～100.14%，準確度滿足要求，見表5。

2.5.2 室間比對研究 RELA-A和RELA-B樣本醛固酮濃度測定結果的偏移分別為-0.22%和-1.53%，符合判斷標準。見表6。

2.6 基質效應

3種混合物計算得到的相對基質效應分別為3.01%、3.52%和3.65%，均＜20%，表明基質效應是否存在并不影響目標分析物的準確定量。見表7。

表5 醛固酮加標回收率結果

表6 2018年RELA樣本各實驗室測定結果

表7 相對基質效應評估結果

2.7 不確定度評定

對3種不同濃度血清樣本進行不確定度評定。3份血清樣本的相對擴展不確定度分別為4.44%、5.36%和4.62%，見表8。3號血清樣本的不確定度來源及數據分析結果見表9，其他2個編號血清樣本的不確定度來源與之相同。

表8 3份不同濃度樣本不確定度的評估結果

表9 3號血清樣本的不確定度來源及數據分析表

3 討論

GC-MS是目前測定類固醇激素公認的參考方法，但測定前必須先對樣本進行衍生化，然后才能進行檢測。與GC-MS相比，LCMS/MS具有許多優勢，無需衍生化，樣本制備更加簡單。目前已有測定醛固酮的LC-MS/MS候選參考方法[1]，采用Sciex API Ⅲ質譜結合大氣壓化學電離源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）電離得到的LOQ為0.042 nmol/L。但該參考方法使用的內標（氟美松）的保留時間與醛固酮的保留時間不同，因此基質成分可能會影響醛固酮和內標的反應。VAN DER GUGTEN等[3]采用API 5000質譜結合ESI電離負離子模式測定醛固酮的LOQ為0.05 nmol/L[3]。本研究的LOQ為0.045 nmol/L，與文獻報道[3-4]基本一致。

離子抑制或增強是質譜方法分析生物樣本中存在的一個主要問題。因此，本研究對基質效應進行了評估，結果顯示相對基質效應為2.56%～3.62%。另外，血清樣本中醛固酮和內標的保留時間為4.16～4.20 min，可與內源干擾物基線分離，能夠幫助減小離子干擾。

本研究建立的ID-LC-MS/MS方法采用LLE將醛固酮從樣本中萃取出來，經過純化、濃縮后進入液相，反相色譜能有效保留醛固酮，將其與其他內源物質分離后，依次進入質譜儀，以減小對醛固酮的基質干擾。質譜分析采用電噴霧電離負離子模式及多反應監測模式同時檢測母離子和子離子，通過2級離子掃描，排除大量干擾離子，使得質譜的化學背景降低，目標物的RSN顯著提高，從而實現檢測的高靈敏度和高特異性。目前使用的醛固酮萃取劑包括甲基叔丁基醚、二氯甲烷和二乙醚。本研究在預實驗時比較了幾種常見的有機萃取溶劑，包括二氯甲烷、二乙醚、甲基叔丁基醚、正己烷和乙酸乙酯。從提取回收率結果看，二氯甲烷和甲基叔丁基醚效果最佳。二氯甲烷位于體系的下層，不易轉移，甲基叔丁基醚位于體系的上層，更易操作。

本研究結果顯示，采用建立的ID-LC-MS/MS方法測定血清醛固酮濃度，線性范圍為0.08～3.55 nmol/L，檢測限為0.012 nmol/L，LOQ為0.045 nmol/L，批內和批間CV分別為＜5%和＜4.1%，平均加標回收率為9 8.5 2%～100.14%，測定RELA樣本的結果偏移＜1.6%。該法的靈敏度、精密度、準確度、特異性和抗干擾性能均符合參考測量程序的要求。

綜上所述，本研究建立的基于ID-LC-MS/MS的血清醛固酮測定方法具有操作簡單、準確性好、靈敏度高、特異性強等特點，有望成為測定血清醛固酮的參考方法。