嗅素蛋白4對卡介苗誘導巨噬細胞凋亡和細菌胞內生存率的影響

王啟源， 姬文蘭， 虞秀鋒

（陜西省結核病防治院內四科，陜西 西安 710100）

結核病（tuberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一種人畜共患傳染病。MTB是一種典型的胞內致病菌，可通過多種不同機制逃逸機體免疫細胞的殺傷及清除，從而在宿主細胞內進行復制和繁殖，并長期在機體內存活。巨噬細胞是宿主抵御MTB感染的第一道防線，也是控制其復制和繁殖的關鍵效應細胞[1]。MTB侵入機體感染宿主后誘導巨噬細胞凋亡，從而激活巨噬細胞抗結核免疫機制，抑制其在體內擴散，增強機體的免疫殺傷能力[2-3]。此外，細胞凋亡可作為細胞內MTB的防御機制，降低其生存能力，研究巨噬細胞的凋亡可進一步明確MTB的致病機制，已成為近年來的研究熱點。

嗅素蛋白4（olfactomedin，OLFM4），是嗅覺介導素蛋白家族成員之一，編碼510個氨基酸，屬于分泌型糖蛋白，廣泛分布于骨髓、小腸、結腸和胰腺等器官。有研究報道，OLFM4通過多種機制參與細胞凋亡、增殖和分化等進程，在抗細菌感染先天免疫、胃腸道炎癥及癌癥中發揮著重要作用[4]，可能成為這些疾病的潛在治療靶點。有研究結果表明，OLFM4在幽門螺桿菌感染患者中上調，且通過調控NF-κB通路參與宿主對幽門螺桿菌感染的先天免疫[5]。此外，OLFM4缺失的小鼠通過上調組織蛋白酶C和下游蛋白酶活性增加了嗜中性粒細胞對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的殺傷[6]。在小鼠中性粒細胞中，OLFM4缺失抑制H2O2誘導的還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADPH）氧化酶活性及凋亡，表明OLFM4可作為治療炎性疾病的潛在靶點[7]。然而OLFM4在卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）誘導的巨噬細胞中的作用機制尚不明確。本研究通過采用BCG菌株感染巨噬細胞RAW264.7建立穩定的MTB感染巨噬細胞模型，探討OLFM4對BCG誘導的巨噬細胞凋亡及其對BCG在巨噬細胞中存活的影響，以期闡明其對巨噬細胞抗BCG感染的免疫調控機制，為治療TB尋找新靶點。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

小鼠RAW264.7巨噬細胞株（中國科學院上海市生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所），BCG菌株（上海生物制品研究所有限公司），DMEM培養基和胎牛血清（美國Hyclone公司），反轉錄試劑盒（美國Promega公司），SYBR Green試劑盒和Cell Death Detection ELISA Kit（德國Roche公司），二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher公司），硝酸纖維素膜（polyvinylidene fluoride membranes，PVDF）和增強化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（美國Millipore公司），OLFM4、Bax、Bcl-2和β-actin抗體（美國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7細胞培養 將RAW264.7細胞置于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素以及100 mg/L鏈霉素的DMEM培養液中，37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養箱中培養，每1～2 d傳代1次。

1.2.2 BCG感染小鼠巨噬細胞RAW264.7 當RAW 264.7細胞穩定后長至70%～80%時，按照感染復數為10∶1接種BCG菌懸液，搖勻后置于37 ℃、5% CO2的培養箱中孵育。4 h后棄上清，以預溫的DMEM培養液洗滌2次，去除未感染進入細胞內的細菌，更換新鮮培養液，作為細胞感染的0 h。分別于BCG感染巨噬細胞0、12、24、48 h時檢測各組OLFM4的表達水平。

1.2.3 細胞轉染 將巨噬細胞RAW264.7（1×105個/孔）接種于12孔板，待細胞匯合度達到50%，采用Lipofectamine 2000試劑將si-OLFM4及陰性對照（si-NC）轉染到RAW264.7細胞，按照說明書進行操作。轉染24 h后，采用實時熒光逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerasechain reaction，RT-PCR）及免疫印跡法驗證轉染是否成功。

1.2.4 RT-PCR檢測mRNA表達水平 采用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，并檢測核酸濃度。將細胞總RNA逆轉錄成cDNA。采用SYBR Green試劑盒通過ABI Prism 7900實時定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）檢測目標mRNA的表達水平。以β-actin為內參照，根據2-ΔΔCt法計算目的mRNA的相對表達量。

1.2.5 免疫印跡法檢測蛋白表達 收集各組細胞，用細胞裂解液提取細胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。50 μg總蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis，SDSPAGE）電泳分離，電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入相應一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL化學發光顯影，拍照；用ImageJ分析各個條帶的吸光度值。計算目的蛋白與β-actin灰度值的比值，并進行統計學分析。

1.2.6 酶聯免疫吸附試驗檢測細胞凋亡 將RAW264.7細胞5×105個/mL接種于6孔板培養皿中，采用酶聯免疫吸附試驗檢測巨噬細胞凋亡。

1.2.7 BCG生存力檢測 采用平板菌落計數法檢測BCG生存率，細菌感染4 h后，用不含血清的DMEM洗滌，除去未被吞噬的細菌。在培養板中再加入完全DMEM培養液1 mL繼續培養。分別于感染后24和48 h棄去培養液，每孔加入500 μL 0.5%Triton X-100裂解細胞，待細胞全部裂解后加入500 μL完全培養液終止裂解。震蕩混勻5 min，將稀釋后的裂解物分3份接種于含油酸白蛋白葡萄糖過氧化氫酶（oleicalbumindextrosecatalase，OADC）的7H11瓊脂平板上，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養3周后進行菌落計數。使用標準程序重復3次計算細菌菌落數。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5軟件進行數據分析和作圖。數據以x±s表示，2個組間比較采用t檢驗，多組數據采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OLFM4在BCG誘導的巨噬細胞RAW264.7中的表達

RT-PCR和免疫印跡法檢測結果顯示，OLFM4在BCG感染的RAW264.7細胞中明顯上調，并呈時間依賴性；RAW264.7細胞轉染si-NC和si-OLFM4結果顯示，轉染si-OLFM4后，OLFM4mRNA和蛋白表達的水平顯著下降。見圖1。

圖1 OLFM4在BCG誘導的巨噬細胞RAW264.7中的表達

2.2 OLFM4對BCG誘導的巨噬細胞凋亡的影響

酶聯免疫吸附試驗結果顯示，BCG感染的RAW264.7細胞凋亡率明顯升高，而OLFM4沉默顯著降低BCG誘導的RAW264.7細胞凋亡。進一步檢測凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達水平，結果顯示，BCG感染的巨噬細胞RAW264.7中，抑凋亡蛋白Bcl-2顯著下調，同時促凋亡蛋白Bax明顯上調，而沉默OLFM4顯著逆轉BCG介導的Bcl-2和Bax蛋白的表達。見圖2。

圖2 OLFM4沉默抑制BCG誘導的巨噬細胞凋亡

2.3 OLFM4對巨噬細胞RAW264.7中BCG存活率的影響

平板菌落計數結果顯示，OLFM4沉默后RAW264.7感染24和48 h的BCG的存活率明顯升高，提示沉默OLFM4能夠抑制宿主對分枝桿菌的防御作用。見圖3。

2.4 沉默OLFM4阻斷BCG介導的TLR2/NF-κB信號通路

為探討OLFM4對BCG誘導的巨噬細胞凋亡的調控機制，我們檢測了OLFM4對TLR2/NF-κB信號的影響，結果顯示，OLFM4抑制BCG誘導的p-p65和TLR2的表達水平下調，而總p65表達水平不變，提示OLFM4沉默可抑制BCG介導的TLR2/NF-κB信號通路。見圖4。

圖3 OLFM4沉默促進胞內BCG存活

圖4 沉默OLFM4抑制BCG誘導的TLR2/NF-κB通路

3 討論

MTB存在于被感染宿主巨噬細胞內，可通過多種機制調控巨噬細胞凋亡，而這種調控與其在宿主細胞內的生存密切相關，影響TB的發生、發展。有研究發現，細胞凋亡是殺死MTB的重要途徑[8-9]，OLFM4可調節宿主對各種細菌感染的先天免疫[5-6]。本研究發現，OLFM4在BCG感染的RAW264.7細胞中明顯升高，BCG感染引發RAW264.7細胞凋亡，而沉默OLFM4能夠抑制BCG誘導巨噬細胞凋亡，并下調促凋亡蛋白Bax表達水平，同時上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，從而抑制BCG誘導的巨噬細胞凋亡。

巨噬細胞作為MTB的主要宿主細胞和靶細胞，二者之間的相互作用較為復雜。細胞凋亡是巨噬細胞殺死MTB的必要條件，而強毒性的MTB可抑制細胞凋亡而誘發壞死，促進細菌逃逸進入周圍組織開始新的感染周期，最終導致MTB傳播。MTB主要在巨噬細胞等宿主免疫系統的細胞內存活和繁殖。本研究結果顯示，OLFM4沉默能夠增強MTB的存活率，促進MTB在巨噬細胞內的生長。OLFM4沉默在BCG感染機體的過程中通過抑制巨噬細胞凋亡參與宿主與BCG的相互作用，這為TB的防治提供了一定的理論基礎，可以幫助開辟一條新的治療途徑。

在MTB感染過程中，巨噬細胞中的多個分子及其相關信號通路參與了巨噬細胞凋亡的調控，對凋亡相關機制的研究將有助于闡明TB的發病機制，并為其防治提供新的思路。NF-κB在先天性免疫系統及適應性免疫應答中具有重要作用，而且MTB感染能夠激活NF-κB信號通路[10-11]。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是先天免疫的關鍵效應分子，能夠與一些病原體特異性配體結合，在宿主細胞中啟動信號轉導通路，并激活NF-κB誘導細胞因子及病原體的適應性免疫反應[12]。TLR2在MTB感染的典型免疫應答過程中具有重要作用[13]。有研究報道，NF-κB依賴的基因轉錄能夠被分枝桿菌BCG或是巨噬細胞中TLR2的分枝桿菌配體調節從而產生大量的細胞因子[14]。本研究發現，下調OLFM4能夠降低p-p65和TLR2的表達，從而抑制TLR2/NF-κB通路的活性，提示TLR2/NF-κB通路參與了OLFM4調節致病性細菌BCG感染的免疫應答進程。

OLFM4沉默可抑制BCG感染的巨噬細胞凋亡，從而增強BCG存活率，其機制可能是通過TLR2/NF-κB信號通路實現，后續我們擬構建TB感染動物模型，進一步從體內證實OLFM4在機體抗BCG感染過程中的免疫調控作用與機制，為進一步研究BCG感染的致病機制提供新的思路，并為研制TB治療藥物提供新靶點。