復合酶法制備玉米活性肽及其功能特性的研究

余平蓮，程立君，李俊杰，熊汝琴，龔建康，馬麗嬌

（昭通學院化學化工學院，云南昭通 657000）

玉米蛋白粉是玉米淀粉生產中的副產物，大約含有60%的蛋白質，但由于其組成復雜、口感粗糙、水溶性非常差，嚴重限制了其在食品工業中的應用[1]。玉米活性肽是以玉米蛋白粉為原料，經過水解后得到的分子量小但是活性很高的短肽分子所組成的混合物[2]，相對于氨基酸或蛋白質來說，玉米活性肽更容易被人體吸收，而且在較大范圍pH 值下完全溶于水，無渾濁和沉淀產生。除此之外，玉米活性肽的熱穩定性好，且沒有毒副作用，玉米活性肽是一種安全可靠的天然食品蛋白[3]。

玉米蛋白水解后得到的玉米活性肽大幅度提高了其溶解性，使起泡性增加，黏性降低，同時去除了不良風味等。而且，通過酶解玉米蛋白制備的玉米肽具有降血壓[4-5]、促進酒精代謝[6-7]、防治肝性腦病、抗氧化[8]、抗疲勞[9]等生理功能。因此，玉米活性肽是一種安全穩定并且性能良好的生理活性肽。

玉米活性肽的制備方法很多，目前使用較多的是酶解法和微生物發酵法，酶解法具有作用專一性強、反應條件溫和、無不良副反應、反應進程容易控制等特點[10]。酶的水解具有很高的選擇性，其水解特性需要用嚴格的條件加以控制。因此，對酶的選擇至關重要。選用堿性蛋白酶和胃蛋白酶2 種酶，以水解度為指標進行雙酶分步水解，以先加胃蛋白酶后再加堿性蛋白酶為添加順序，考查制備玉米肽的最佳條件，在酶解合適條件下，研究玉米肽的抗氧化功能，為玉米肽的制備和功能研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米蛋白粉，邢臺平安糖業有限公司提供；堿性蛋白酶（10 萬U/g），四川省山野生物科技有限公司提供；胃蛋白酶（3 000 U/g），蘇州科銘生物技術有限公司提供；DPPH 自由基，臨邑縣宏源化工商行提供；牛血清白蛋白，上海雪滿生物科技有限公司提供；考馬斯亮藍G250，上海浩然生物技術有限公司提供。

752PC 型紫外可見分光光度計，天津冠澤科技有限公司產品；XMTD-204 型智能數顯恒溫水浴鍋，天津市歐諾儀器儀表有限公司產品；FE20 型實驗室pH 計，梅特勒—托利多儀器（上海） 有限公司產品；KQ2200DE 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 酶解液的制備

取一定量的玉米蛋白粉，將其制成質量分數為6%的玉米蛋白溶液。用NaOH 溶液或HCl 溶液調節pH 值至酶作用的最適值，于恒溫水浴鍋中加熱至酶作用的溫度。將一定量酶用磷酸二氫鉀緩沖液溶解活化后加入到蛋白液中，啟動反應。反應每隔0.5 h調pH 值至起始值，達到預定時間后停止加熱攪拌，酶解結束。

1.2.2 雙酶水解法

基本操作同1.2.1，按胃蛋白酶作用條件進行水解，一定時間后，再調至堿性蛋白酶的作用條件，水解一定時間至酶解結束。

1.2.3 單因素試驗

（1） 設定堿性蛋白酶酶解時間1.0 h，加酶量0.064 g，pH 值為9，按照40，50，60，70 ℃酶解溫度進行水解；胃蛋白酶酶解時間1.0 h，加酶量0.004 g，pH 值為2，按照50，55，60，65 ℃酶解溫度進行水解，考查溫度對酶解效果的影響，選出較優水解溫度。

（2） 設定堿性蛋白酶酶解溫度50 ℃，加酶量0.064 g，pH 值為9，按照0.5，1.0，1.5，2.0 h 酶解時間進行水解；胃蛋白酶酶解溫度60 ℃，加酶量0.004 g，pH 值為2，按照0.5，1.0，1.5，2.0 h 酶解時間進行水解，考查時間對酶解效果的影響，選出較優水解時間。

（3） 設定堿性蛋白酶酶解溫度50 ℃，酶解時間1.0 h，pH 值為9，按照加酶量0.032，0.064，0.096，0.128 g 進行水解；胃蛋白酶酶解溫度60 ℃，酶解時間1.0 h，pH 值為2，按照加酶量0.002，0.004，0.006，0.008 g 進行水解，考查加酶量對酶解效果的影響，選出較優加酶量。

（4） 設定堿性蛋白酶酶解溫度50 ℃，酶解時間1.0 h，加酶量0.064 g，按照pH 值9，10，11，12進行水解；胃蛋白酶酶解溫度60 ℃，酶解時間1.0 h，加酶量0.004 g，按照pH 值1.8，1.9，2.0，2.1進行水解，考查pH 值對酶解效果的影響，選出較優pH 值，結果以水解度為指標，進行單因素試驗。

1.2.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對酶解溫度、酶解時間、加酶量及pH 值4 個因素選取3 個水平進行考查，以水解度為評價指標，采用L9（34）正交試驗表進行正交試驗優化。同樣，以該因素表通過DPPH 自由基清除試驗考查了玉米肽抗氧化能力。

堿性蛋白酶試驗因素與水平設計見表1，胃蛋白酶試驗因素與水平設計見表2。

表1 堿性蛋白酶試驗因素與水平設計

表2 胃蛋白酶試驗因素與水平設計

1.2.5 雙酶水解試驗

（1） 酶添加順序對水解效果的影響試驗。選取6%的底物質量分數按酶解單元操作進行試驗，按不同順序加酶。先加胃蛋白酶設定酶解條件為酶解時間1.5 h，加酶量0.006 g，pH 值為2，溫度60 ℃，再加堿性蛋白酶，調節酶解條件為時間1.5 h，加酶量0.096 g，pH 值為10，溫度50 ℃。

（2） 不同溫度對水解效果的影響試驗。堿性蛋白酶的最適溫度為50 ℃，胃蛋白酶的最適溫度為60 ℃，在底物濃度為6%的條件下，設置2 組試驗，一組是先加胃蛋白酶后加堿性蛋白酶，按酶解單元操作對玉米蛋白粉進行雙酶水解，胃蛋白酶設定酶解條件為酶解時間1.5 h，加酶量0.006 g，pH 值為2，溫度50 ℃，再加堿性蛋白酶，調節酶解條件為時間1.5 h，加酶量0.096 g，pH 值為10，溫度50 ℃。另一組先加胃蛋白酶后加堿性蛋白酶，按酶解單元操作對玉米蛋白粉進行雙酶水解，胃蛋白酶設定酶解條件為酶解時間1.5 h，加酶量0.006 g，pH 值為2，溫度60 ℃，再加堿性蛋白酶，調節酶解條件為時間1.5 h，加酶量0.096 g，pH 值為10，溫度60 ℃。

（3） 不同時間對水解效果的影響試驗。根據上述確定的條件，再分別確定胃蛋白酶和堿性蛋白酶的水解時間。在胃蛋白酶分別水解1.0，1.5，2.0 h時，分別加堿性蛋白酶再水解2 h，在堿性蛋白酶水解1.0，1.5，2.0 h 時分別測定水解度。

1.2.6 水解度（DH） 的測定

水解度（DH） 的測定采用pH-stat 滴定法[11]，pH-stat 法是依據恒定的pH 值條件下酶水解蛋白后形成的自由羧基、自由氨基或氨基酸殘基數目不等，多肽在不同的pH 值下解離狀態的不同而計算蛋白的水解度。水解開始時，調節體系的pH 值到某值，反應結束后再測定體系的pH 值，用一定質量分數的NaOH 溶液將體系的pH 值調回到反應開始時的值，通過記錄堿液的消耗量，得出蛋白的水解度。按下式計算出水解度：

1.2.7 DPPH 自由基清除試驗

采用對DPPH 自由基清除活性的測定獲得玉米活性肽的抗氧化活性，具體操作為：稱取0.049 g DPPH 自由基溶解在50 mL 無水乙醇中，然后取6 mL DPPH 自由基溶解液于試管中，加入8 mL 酶解液，在室溫下放置30 min。立即倒入比色杯中，于波長517 nm 處進行實踐掃描，測定吸光度，重復3 次。再用8 mL 蒸餾水做空白試驗。

自由基清除活性計算如下：

1.3 數據統計分析

采用SPSS17.0 軟件進行單因素方差分析（ANVO），顯著水平為p<0.05；采用Origin 9.0 軟件進行圖形處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

不同溫度對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響見圖1。

圖1 不同溫度對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響

由圖1 可知，隨著溫度的增加，堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度均呈現先上升后下降的趨勢。堿性蛋白酶在50 ℃時水解度達到最大值，這是因為在酶的最適溫度反應活性最強，超過酶的最適溫度后，酶分子的空間結構由于溫度的增加而發生改變，導致酶活性減弱或喪失，而影響催化效果，因而水解度急劇下降，選擇40，50，60 ℃3 個水平參與正交試驗。胃蛋白酶也是同樣的原理，在60 ℃時水解度達到最大值，超過最適溫度后，水解度下降，因此選擇55，60，65 ℃參與正交試驗。

不同時間對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響見圖2。

圖2 不同時間對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響

由圖2 可知，隨著時間的增加，堿性蛋白酶和胃蛋白酶的水解度均呈現上升的趨勢。堿性蛋白酶在反應時間少于1 h 時，水解度顯著增高，而反應時間超過1 h 后，水解度上升緩慢。這是因為剛開始酶與底物接觸充分，快速發生反應，但是隨著時間的增加，底物濃度降低，生成的產物也隨之減少，反應速度也降低。胃蛋白酶的水解度隨時間的延長而增高。2 組試驗均選擇1.0，1.5，2.0 h 參與正交試驗。

不同加酶量對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響見圖3。

圖3 不同加酶量對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響

由圖3 可知，隨著加酶量的增加，堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度均呈現先快速上升后緩慢上升的趨勢，這可能是因為受到底物濃度的限制。

pH 值對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響見圖4。

圖4 pH 值對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響

由圖4 可看出，隨著pH 值的增加，水解度均呈現先上升后下降的趨勢，堿性蛋白酶在pH 值為10時水解度達到最大，胃蛋白酶在pH 值為2 時水解度達到最大。這是因為pH 值過高或過低都會改變酶的空間結構，甚至使酶失活；另外，pH 值還可能改變底物的解離狀態，影響底物和酶的結合，進而影響水解的效果。因此，堿性蛋白酶和胃蛋白酶分別選取pH 值為9，10，11 和1.9，2.0，2.1 參與正交試驗。

2.2 酶解條件的優化結果

通過正交試驗，確定了堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解的最適溫度、時間、加酶量和pH 值。

正交試驗結果見表3。

通過極差分析得出，堿性蛋白酶水解度各因素影響的主次關系為D>A>C>B，pH 值對水解度的影響最大，最佳配比為A3B2C3D3，即最適溫度為60 ℃，最佳時間為1.5 h，最佳加酶量為0.128 g，最佳pH 值為11。此結果不在正交試驗表中，經過驗證試驗，A3B2C3D3條件下進行水解得到水解液的水解度為13.63%，高于A3B2C1D3條件下水解度，因此選擇A3B2C3D3作為最佳值。胃蛋白酶水解各因素影響的主次關系為C>D>A>B，加酶量對水解的影響最大，最佳配比為A2B2C3D1，即最佳溫度為60 ℃，最佳時間為1.5 h，最佳加酶量為0.008 g，最佳pH 值為2.1，在此條件下進行水解得到水解液的水解度為22.12%。

表3 正交試驗結果

2.3 酶添加順序對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解效果的影響

試驗結果顯示，先加胃蛋白酶后加堿性蛋白酶的作用效果好于先加堿性蛋白酶后加胃蛋白酶。前者水解液的水解度為22.12%，而后者為13.63%。可能是因為胃蛋白酶水解能力較強，作用位點較多，水解一段時間之后，得到的可溶性短肽暴露出了較多的利于堿性蛋白酶的作用位點，水解效果較好。

2.4 不同溫度對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解效果的影響

試驗結果顯示，50 ℃時水解度為28.74%，而60 ℃時，水解度為28.96%，這可能是因為胃蛋白酶起到水解的主導作用，所以確定雙酶水解的溫度為60 ℃。

2.5 不同反應時間對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解效果的影響

不同反應時間對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響見圖5。

圖5 不同反應時間對堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解度的影響

由圖5 可知，胃蛋白酶水解1.5 h 時加入堿性蛋白酶，水解度達到最高值。因此，確定胃蛋白酶的水解時間為1.5 h。因加入堿性蛋白酶后水解度持續上升，確定堿性蛋白酶的水解時間為2 h。雙酶水解效果與單酶水解效果相比，水解度得到了明顯的提高，且水解玉米蛋白粉的效果更徹底，肽的分子量越小，更加符合生理活性肽的要求。

2.6 玉米肽抗氧化性的測定結果

利用單酶和雙酶水解后的玉米肽進行抗氧化試驗，以自由基清除率為指標。

酶解后的玉米肽抗氧化最佳條件見表4。

表4 酶解后的玉米肽抗氧化最佳條件

由表4 可知，在2 種酶抗氧化的最佳條件下及在此最佳條件下的雙酶水解中，堿性蛋白酶的自由基清除率最大為25.62%。

3 結論

采用堿性蛋白酶和胃蛋白酶對玉米蛋白粉進行酶解制備玉米活性肽，以水解度為指標，分別對2 種酶水解進行單因素試驗，選取最佳反應條件，進行雙酶分步試驗（先加胃蛋白酶后加堿性蛋白酶），得到水解度與單酶試驗結果進行比較，然后進行正交試驗，得到最優條件，并測定DPPH 自由基清除率以及酸度得出玉米活性肽的功能。結果發現，通過正交試驗得到2 種酶的最水解條件為堿性蛋白酶最適溫度60 ℃，最佳時間1.5 h，最佳加酶量0.128 g，最佳pH 值11，在此條件下進行水解得到水解液的水解度為13.63%；胃蛋白酶最佳溫度為60 ℃，最佳時間為1.5 h，最佳加酶量為0.008 g，最佳pH 值為2.1，在此條件下進行水解得到水解液的水解度為22.12%。

由于酶具有的單一性特點導致單一酶水解肽鍵位點有限，所以考慮使用雙酶水解的方法來提高水解液的水解度。由于2 種酶最適pH 值相差較大，不能同時加入水解液中，所以采用先加一種酶反應一段時間后再調至另一種酶的作用條件，加入另一種酶反應相應時間的分布水解方式。確定了雙酶水解的方法后再確定酶添加順序、溫度、時間等條件。最終結果為雙酶水解液的水解度29.88%，明顯高于單酶水解，可見雙酶水解制備玉米肽的產量較高。

在最優條件下，采用堿性蛋白酶水解得到的玉米肽對DPPH 自由基清除率最大為25.62%，抗氧化性最好。