一株優良野生葡萄酒菌株的性能分析

葛含靜

（陜西學前師范學院 生命科學與食品工程學院，陜西西安 710100）

在釀制葡萄酒的過程中，酵母的種類與性能對成品的品質具有無可替代的影響。不同種類、不同來源的酵母，其代謝途徑必有差異，導致所釀酒的色澤和風味便會有所不同[1-2]。目前，國內葡萄酒企業獲取葡萄酒釀造酵母的主要途徑有2 種，即利用當地特有的葡萄資源選育優良的本土酵母，或進口國外優良的葡萄酒釀造酵母。自然發酵葡萄酒時，附著在葡萄果實、果梗，甚至葉片上的酵母都會參與酒的發酵，從而使酒液具有獨特的地域性品質[3]。各年份各批次之間酒的品質不能穩定，存在或多或少的差異[4]。為了使葡萄酒品質穩定，許多酒企大量使用國外優良酵母進行發酵，這樣雖能穩定發酵速度和風味，但極大降低了本土酵母的貢獻，導致產品同質化嚴重，難以凸顯酒的地域特色[5-7]。研究利用本土特有葡萄資源，通過自然發酵篩選出的優勢釀造酵母對當地微環境的適應性非常好，易于在釀造過程中發揮主導作用，并能很好地保證產區的典型 性[4，8]。因而，本土釀造酵母的選育研究成為當下葡萄酒行業的研究熱點之一[9]。

西安擁有多個成熟、規模化的葡萄種植基地，本土化的葡萄酒釀造酵母資源極為豐富。作為西安地區特有的兼鮮食與釀造的葡萄品種，戶太八號果粒深紫味道甜美，是釀造葡萄酒的優質原料。對前期篩選出的適合戶太八號桃紅葡萄酒釀造的菌株NJ7進行鑒定，并對發酵條件進行優化，對所釀酒樣品質進行分析，并將之與商品釀酒酵母D254 所釀酒樣的品質進行比較，為釀造出具有西安本土特色的葡萄酒提供試驗數據。

1 試驗材料與培養基

1.1 試驗材料

成熟戶太八號葡萄，2017 年9 月采集于西安市白鹿原產區，破碎、壓榨后自然釀制；商品釀酒酵母D254。

1.2 培養基

WL營養瓊脂培養基[10]，無機鹽類KH2PO40.55 g/L，KCl 0.425 g/L，CaCl20.125 g/L，MgSO40.125 g/L，FeCl30.025 g/L，MnSO40.0025 g/L，溴酚綠0.022 g/L，pH 值5.5。

保藏培養基、活化培養基，均為YPD 培養基。

上述培養基均在121 ℃下高壓滅菌15 min 后備用，所有試劑均為分析純或生物純。

2 試驗方法

2.1 菌種鑒定

表型鑒定[11-12]：菌株NJ7 接種于WL 營養瓊脂培養基，于25 ℃條件下培養72 h，觀察菌落形態及細胞形態。

分子生物學鑒定[13-14]：珠磨法提取菌株NJ7 基因組DNA，以之為模板，NL1 和NL4 為引物，對26S rRNA D1/D2 區域擴增并測序，進行系統發育分析，確定菌株NJ7 的生物學地位。

2.2 發酵工藝參數優化

在1 L 葡萄鮮漿中按3%接種量（V/V） 接入菌株NJ7 種子液，并加40 mg/L 二氧化硫溶液，恒溫發酵72 h，依據酒樣酒精度優化菌株NJ7 的最適發酵溫度和pH 值。

2.3 酒樣品質分析

以1.0%接種量（V/V） 接種菌株NJ7 的種子液于裝有10 L 葡萄鮮漿的發酵罐中，并加入40 mg/L二氧化硫溶液，于25 ℃條件下發酵5 d 后取樣，以轉速5 000 r/min 離心，測定所釀酒樣的酒精度、總酸、總糖等理化指標，以酒樣的滋氣味、澄清度等作為感官指標。采用商業菌株D254 作對照菌株。最后，通過小試試驗來驗證優化后的適合菌株NJ7 的發酵條件。

2.4 香氣成分分析

GC-MS 分析。取6 mL 酒樣，于40 ℃下水浴加熱15 min，頂空萃取35 min，解析5 min[15]，以D254作對照。升溫程序與色譜條件同文獻15。

3 結果與分析

3.1 菌種鑒定

菌株NJ7 的菌落形態和個體形態見圖1。

圖1 菌株NJ7 的菌落形態和個體形態

菌株NJ7 的菌落呈球形突起且表面光滑，奶油色，略帶淡綠，不透明（圖1（a）），具有典型釀酒酵母的形態特征；菌體卵圓形，單端芽殖（圖1（b））。

菌株NJ7 的26S rRNA 序列擴增產物見圖2，菌株NJ7 的系統發育樹見圖3。

圖2 菌株NJ7 的26S rRNA 序列擴增產物

圖3 菌株NJ7的系統發育樹

菌株NJ7 與S. cerevisiaeAB733454.1 同枝，26S rRNA 序列相似度為100%。結合表型鑒定結果，菌株NJ7 應為釀酒酵母。

3.2 發酵工藝優化與酒樣品質分析

菌株NJ7 發酵溫度優化見圖4，菌株NJ7 發酵pH 值優化見圖5。

圖4 菌株NJ7發酵溫度優化

圖5 菌株NJ7發酵pH 值優化

由圖4、圖5 及小試發酵驗證試驗可知，菌株NJ7 最優發酵條件為發酵溫度24 ℃，pH 值5.0。

菌株NJ7 和D254 所產酒樣的理化指標見表1，菌株NJ7 和D254 所產酒樣的感官評定結果見表2。

表1 菌株NJ7 和D254 所產酒樣的理化指標

表2 菌株NJ7 和D254 所產酒樣的感官評定結果/分

由表1 和表2 可知，2 株菌所產酒樣的各項指標非常接近；菌株NJ7 酒樣的色度和花色苷含量略低，其余指標均高于D254 酒樣。綜上，菌株NJ7 具有良好的產業化應用價值。

圖6 菌株NJ7 所釀酒樣香氣成分GC-MS 總離子圖

圖7 D254 所釀酒樣香氣成分GC-MS 總離子圖

3.3 酒樣香氣成分分析

菌株NJ7 所釀酒樣香氣成分GC-MS 總離子圖見圖6，D254 所釀酒樣香氣成分GC-MS 總離子圖見圖7，菌株NJ7 與菌株D254 所釀酒樣主要香氣成分對比見表3。

由表3 可知，菌株NJ7 和D254 所釀酒樣中分別可檢出揮發性化合物64 種與53 種，主要香氣成分均為醇、酯和酸；與D254 相比，菌株NJ7 酒樣中優勢含量的香氣成分有16 種，2- 庚醇、壬醛、異戊酸乙酯等香氣良好，正己醇、苯乙醇、乙酸異戊酯等香氣優雅；各種香氣成分與特有組成比例形成了菌株NJ7 所釀酒液的獨特風味。

4 結論

前期研究中獲得的優良菌株NJ7 經鑒定是釀酒酵母，發酵釀制的戶太八號酒樣理化指標均接近商品釀酒酵母D254，發酵性能良好，具有工業化應用潛力，可作為西安地區葡萄酒釀制的特征酵母商品化的出發菌。