兩種改良法提取馬鈴薯RNA的對比

蘭成苑　帥港航　胡艷燕　王用帥

【摘 要】不同的植物組織都有較優化RNA提取方法。本試驗以馬鈴薯普通栽培品種“師大7號”和“Δ5”塊莖嫩芽為材料，對原始的SDS酚法進行改良提取總RNA，并與Logeman法比較，通過電泳實驗比較提取效果，以確定適合幾種植物組織的最優RNA提取方法。結果表明：Logeman法含有輕微的硫氰酸肌鹽污染。而改進的SDS酚法優解決了淀粉、多糖、多酚等干擾馬鈴薯嫩尖總RNA提取的問題。電泳條帶結果表明：Logeman法提取的總RNA有部分降解，條帶不清晰，部分有托尾現象，改進的SDS酚法提取的RNA條帶清晰無托尾，總RNA質量符合后續試驗要求。

【關鍵詞】提取RNA馬鈴薯;改進的SDS酚法;Logeman法

一、前言

馬鈴薯屬于茄科茄屬一年生草本塊莖植物，主要食用部位是由地下匍匐莖頂端膨大而形成的塊莖——營養貯藏器官，淀粉是它的主要貯藏物質。具有粘性強、膨脹力強、而且糊化性能好、糊漿透明度高等一系列優點，又廣泛應用于石油、醫藥、建筑和紡織等系列眾多領域。但因為馬鈴薯松散的淀粉結構，又使其不能在更大范圍內發揮更優質的作用，所以現在馬鈴薯育種的核心問題之一就是進一步改良馬鈴薯淀粉現有的加工品質。從目前的研究熱點和發展趨勢來看，在分子水平上研究其淀粉生物合成關鍵酶及其基因表達已然成為了研究中心。而進行植物分子生物學研究[1]的必要前提就是提取植物組織的 RNA，因為要構建cDNA 文庫、進行Northern 雜交、 RT-PCR 等都需要高質量的 RNA 。同時，RNA的提取還有助于獲得轉錄組，作為連接生物功能的蛋白質組和基因組遺傳信息的紐帶。目前被研究最多最深入的生物體調控方式也就是對轉錄水平的調控。轉錄組更能為后續很多研究提供出更多有用的信息。高效提取優質RNA也對轉錄組的研究有著重要意義。目前常采用的植物總 RNA 提取方法主要有異硫氰酸胍法、TAB法、Chan法、SDS法、Logeman 、苯酚法 、Trizol 法等。此外，一些商業化的試劑盒也被用于植物組織 RNA 的提取。但很多方法在實驗過程中，由于馬鈴薯塊莖含有大量的多糖、酚類化合物和次級代謝產物，液氮研磨過程中塊莖里大量淀粉會失水成干粉狀，加入變性液后干粉迅速吸水呈凝膠狀，即使通過高速離心亦無法使其與液相分離，導致 RNA 被包裹其中而無法提取[3]。而塊莖中的多糖會使 RNA 沉淀難溶于水，或者溶解后成黏稠狀，同時多糖可以抑制許多酶的活性，嚴重影響后續分子生物學試驗 。多酚類化合物在研磨后勻漿時會被釋放出來，氧化后使勻漿液變為褐色，被氧化的酚類化合物（如醌類）能與 RNA 穩定結合，從而影響 RNA 的分離純化[4]。這些物質不僅會影響馬鈴薯總 RNA 提取的產量和質量，而且會嚴重干擾后續反轉錄反應和 PCR 擴增。除此以外，常用的 RNA 提取方法對于處理馬鈴薯塊莖此類的特殊材料， 還存在分離產量低和污染嚴重等問題。 本試驗采用 Logeman法和改進的SDS酚法提取馬鈴薯嫩尖 RNA ， 并對這兩種方法的提取效果進行比較與分析，并通過電泳驗證提取所得的總RNA質量。結果表明，Logeman法雖然能提取較多RNA，但其電泳結果并沒有改進的SDS酚法提取的RNA質量好，且存在拖尾現象，條帶不清晰。一般的實驗環境條件下，改良的SDS酚法更有利于多酚類植物RNA的提取。

二、實驗過程

1.準備過程：（1）外界環境RNase 的滅活：RNA提取的前處理。RNA提取過程中所用研缽、藥匙、玻璃器皿于180℃干熱處理了4h;（2）塑料容器、耗材及配制藥品的H2O均用終濃度為0.1%的DEPC處理過夜，并用烘箱烘干;（3）試驗材料及儀器的預冷：將剪刀剪下的馬鈴薯嫩尖樣品用1%DEPC水浸泡清洗后，晾干待用;（4）將研缽用液氮進行預冷處理。

2.實驗過程：（1）改良的SDS酚法;（2）Logeman法;（3）凝膠制作;（4）電泳過程。

三、實驗數據分析

（一）一種方法提取馬鈴薯塊莖總RNA完整性比較

將改良的SDS酚法、Logeman 法提取的馬鈴薯塊莖總 RNA 各2μL，分別加水 10 μL，再加2μL DEPC緩沖液，在1.0% 瓊脂糖凝膠上電泳。由電泳結果可以看出，Logeman 法提取的兩個品種的 RNA 有嚴重拖尾現象，改良的SDS酚法提取的 RNA 條帶相對清晰，且師大7號形成的條帶比Δ5形成的條帶要清晰，但查閱相關文獻得知，導致這種結果的原因是實驗過程中操作不當或者Δ5提取的RNA降解相對較快，但總的來說，本實驗提取出的RNA可以作對比所用。

現在用的是DNA的markertk，但并不影響比較過程，結果僅供參考。

本圖示中“1”為改進的SDS酚法提取“師大7號”的RNA電泳結果;

“2”為Logeman 法提取的“師大7號”的RNA電泳結果;

“3”為改進的SDS酚法提取“Δ5”的RNA電泳結果;

“4”為Logeman 法提取“Δ5”的RNA電泳結果;

（二）兩種方法提取馬鈴薯塊莖操作程序比較（表2）

Logeman法、改進的SDS酚法種方法都經過研磨、抽提、沉淀、洗滌等步驟，各方法只有研磨一致，其余步驟都有所區別，導致試驗時間差異較大，但改進的SDS酚法各種實驗試劑步驟相對更適合現代實驗室操作。

四、結論

Logeman法利用鹽酸胍、β-巰基乙醇2 種試劑來抑制 RNase 活性，同時裂解核蛋白，酚、氯仿反復抽提去除蛋白質，醋酸和乙醇選擇性沉淀 RNA，然后再用 3 mol/L 醋酸鈉（pH值為5.2）去除多糖，可大量提取馬鈴薯塊莖總 RNA。但本實驗中Logeman 法未得到較高質量的 RNA，原因在于實驗操作過程中可能存在誤差，且降解程度較大，相比之下，沒有改進的SDS酚法提取RNA的效果好。但其成本較低，且耗時相對較少，也不失為一個規范操作以提取RNA的好方法。

改進的SDS酚法用異丙醇兩次，最后對沉淀洗滌兩次，且電泳結果表明：改進的SDS酚法提取的RNA完整性相對較好;整個過程無試劑污染，更適合于實驗室操作。

【參考文獻】

[1]趙寶勰，程李香，林必博，等. 兩種馬鈴薯塊莖總 RNA 提取方法的比較[J]. 廣東農業科學，2010 （1）：124 -127.

[2]王關林，方宏筠. 植物基因工程原理和技術[M]. 北京：科學出版社，1998：609.

[3]楊建文，宋波濤，李亞軍，等. 一種簡單有效的提取馬鈴薯塊莖總RNA 方法[J]. 農業生物技術學報，2006，14 （2）：297 -298.

[4]趙亞力，馬學斌. 分子生物學基本實驗技術[M]. 北京：清華大學出版社，2006：49 -53.

作者簡介：蘭成苑、性別：女、籍貫：四川內江、研究方向：教育;胡艷燕、性別：女、籍貫：江西撫州、研究方向：教育;帥港航、性別：男、籍貫：四川德陽、研究方向：生物教育;王用帥、性別：男、籍貫：四川資陽、研究方向：教育。