抗腫瘤藥物含多柔比星結構新化合物STL的體外細胞抗腫瘤實驗

張東明

摘要：惡性腫瘤造成大量生命危害甚至死亡，主要的治療方法有：手術切除、化學療法、放射療法、基因療法等，其中的化學療法被廣泛使用。但由于化學療法使用的藥物多屬于細胞毒性藥物，在治療的同時嚴重地破壞組織的結構和功能，多不能連續長時間和大劑量使用，在臨床上有明顯的不良反應，嚴重地限制了化療藥物的使用，尋找強效低毒的化療藥物是醫療不斷探索的課題。

含多柔比星結構新化合物STL（簡稱STL）是在多柔比星DOX的分子上加上一個敏感的靶向集團，構成了一個全新藥物，其對正常細胞識別不強，可連續多次給藥。本實驗采用MTT法通過STL同多柔比星（DOX）在對體外細胞的抑制作用比較，結果表明對前列腺癌PC3效果良好。

關鍵詞：含多柔比星結構新化合物STL，腫瘤，前列腺癌PC3

1.實驗材料

1.1主要試劑：STL 天津斯濤利公司，DOX北京華奉聯博公司，EDTA美國Gibco 公司，胰酶上海生物工程有限公司，PBS上海生物工程有限公司，二甲基亞砜（DMSO）上海生物工程有限公司。

常規試劑：75%乙醇，無水乙醇，氯化鈉（NaCI），氫氧化鈉（NaOH），氯化鉀（KCI），磷酸二氫鉀（KH2PO4），磷酸氫二鈉（Na2HPO4），生理鹽水，多聚甲醛等國產分析純。

1.2 藥物配制

STL的分子量為787，設置濃度為2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L，稱取STL7.87mg，溶于10mL生理鹽水中，配制成1000μmol/L的濃度，過濾后儲存。

DOX的分子量為585，設置濃度為8μmol/L，稱取DOX 5.85mg，溶于10mL生理鹽水中，配制成1000μmol/L的濃度過濾后儲存。

1.3試劑配制

1） PBS液配制：精確稱取氯化鈉（NaCl）8.0g，氯化鉀（KCl）0.2g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.44g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）0.24g，在燒杯中用蒸餾水溶解，準確定容至1000mL，高壓滅菌后儲存。

2） DMEM液配制：取DMEM干粉培養基溶于超純水中，磁力攪拌到充分溶解，加NaHCO3及雙抗 ，震蕩攪拌使之溶解，調節溶液pH值至 7.0～7.5，實驗室超純水補足至 1000 mL，用0.22 μmol/L 的濾膜過濾除菌，然后置于 4℃冰箱保存。用前加入胎牛血清調節至終濃度 10%。

3） MTT（5 mg/mL ） 液：精確稱取MTT 500 mg，加入到PBS液 100 mL中充分溶解后，經 0.22 μmol/L的無菌濾膜過濾除菌，放置于-20℃保存。

4） 胰酶消化液配制：精密稱取胰蛋白酶0.8克，置于100mL的D-Hanks液中，使溶脹完全，然后定容至800mL，得胰蛋白酶溶液。過濾除菌，4℃保存，備用。

2.實驗方法

MTT比色法

含多柔比星結構新化合物STL對人前列腺癌PC3細胞的作用

2.1細胞復蘇：

從液氮灌中取出凍存的裝有前列腺癌PC3細胞的凍存管，投入37℃的水浴箱中，并輕輕震動使其盡快融化，開封，用過火的槍頭吸出細胞懸液，注入到裝有9mLPPS離心管中，用1200r/min 低速離心5min，除去上清液，加入DMEM清洗棄上清液，然后再加入DMEM，用槍頭輕輕吹打至均勻散開使其成單細胞懸液，接種到培養瓶中，標記后放入到5%的37℃ CO2培養箱中，每日更換培養液。

2.2細胞傳代：

棄去舊的培養基加5mLPBS清洗2次，洗去懸浮的死亡細胞，加入已經配制好的胰酶液，放到培養箱中消化細胞1min，取出鏡下觀察細胞漂浮后，加入5mLDMEM終止細胞消化，反復輕輕吹打均勻，使其成為單細胞懸液，用1200r/min 低速離心，5min，去除上清液，加入DMEM，反復吹打成單細胞懸液，然后分裝到培養皿中，標記后培養。

2.3 MTT法誘導細胞凋亡實驗：

1 收集對數期的細胞，調整細胞懸液的濃度，每孔加入100uL懸液，鋪板使待測細胞密度?10000/孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2 5%CO2、恒溫箱37℃孵育，至細胞在96孔板單層鋪滿孔底，加入梯度濃度的藥物及陽性對照藥物DOX濃度8μmol/L，藥物濃度設置為2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L，每孔100uL，設3復孔。

3 5% CO2恒溫37℃孵育72小時，倒置顯微鏡鏡下觀察。

4 每孔加入20uL MTT溶液（5mg/mL），繼續培養4h。

5 終止培養，緩慢吸去孔內的培養液。

6 每個孔中加入150uL DMSO，放在搖床上振蕩10min，觀察藍紫色的結晶物甲瓚充分溶解。使用酶聯免疫檢測儀在OD492nm處測量各組待測孔的吸光值。

7 同時根據以上設置調零孔（DMEM、二甲基亞砜、MTT）和對照孔（細胞、藥物溶解質、DMEM、MTT、二甲基亞砜）。

3.含多柔比星結構新化合物STL對人前列腺癌PC3細胞的抑瘤效應

通過實驗含多柔比星結構新化合物STL同DOX比較對人前列腺癌PC3細胞的抑瘤效應，給與2μmol/L-8μmol/L的不同濃度受試藥物STL和8μmol/L濃度DOX，72小時各組別的作用：72小時STL組2μmol/L到8μmol/L組抑制率隨著劑量增加抑制率增加，呈現劑量依賴性，相同給藥劑量8μmol/L比較，STL抑瘤率28%明顯高于DOX組19%（表1），STL對人前列腺癌PC3細胞的抑瘤率呈現隨著劑量增加而增加的劑量依賴性。

實驗總結

含多柔比星結構新化合物STL是在多柔比星DOX的分子上加上一個敏感的靶向基團，構成了一個全新藥物，通過靜脈注射給藥，STL通過靶向基團與機體血液中的白蛋白結合在血液及正常的細胞環境下比較穩定，到達腫瘤組織后，由于腫瘤組織的特殊生長和代謝環境，靶向基團對其敏感，通過細胞攝取作用進入到腫瘤細胞中，釋放出有細胞毒性的DOX，使腫瘤細胞凋亡，其實驗結果及機理表明抗腫瘤作用優于多柔比星，是較DOX高效低毒的抗腫瘤藥物。

（吉林省中醫藥科學院?吉林長春?130021）