串聯質譜法實時直接測定茶葉中γ-氨基丁酸含量

屠鈺 李無雙 朗文成 馬琳 武國華

摘?要?對茶葉中γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）等多種功能性活性物質的快速檢測，有利于茶葉資源的開發和有效利用。本研究建立了一種利用實時直接分析（DART）離子源與三重四極桿串聯質譜聯用快速高效定量分析茶葉中GABA含量的方法，測定了10種茶葉中GABA的含量。結果表明，不同茶葉中GABA的含量存在較大差異，其中九香翠芽中GABA含量最高，達到227.2 μg/g; 其次是信陽毛尖，含量為161.2 μg/g; 日照綠茶的GABA含量最低，為75.6 μg/g。本方法測得的結果與2，4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色譜（HPLC）檢測法有較好的一致性。本方法簡便、高效，為快速篩選具有高含量GABA的茶葉品種提供了一種簡單有效的方法。

關鍵詞?茶葉; γ-氨基丁酸; 實時; 直接分析; 三重四極桿串聯質譜; 高效液相色譜

1?引 言

茶葉是世界三大植物性飲料之一，其中，氨基酸是茶葉中重要的含氮物質。茶葉中含有的主要氨基酸包括茶氨酸、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）等[1～3]，這些氨基酸不僅對茶葉的口感、香氣的形成有重要影響，同時也具有一定的保健功能[4～8]。其中，GABA是一種天然的非蛋白質氨基酸，也是一種重要的中樞神經系統抑制性神經遞質，具有豐富的生理活性[5]。藥理學研究表明，GABA具有一定的降血壓、降血糖、治療神經退行性疾病、抗抑郁、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、促進睡眠、增強記憶力等作用[6～13]。

目前，測定GABA的方法包括放射受體法[14]、氨基酸分析儀法[15]、氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）[16]、液相色譜法[17]、電泳法[18]、比色法[19]等。Syu等[17]采用高效液相色譜（HPLC）法測定了茶葉中的游離氨基酸含量，結果表明，利用丹磺酰氯作為氨基酸的發色標記試劑可準確地測定茶葉中氨基酸的含量。湯茶琴等[18]采用紙電泳法測定了茶葉中GABA和谷氨酸含量，結果表明，GABA和谷氨酸分離效果較好，斑點清晰，洗脫液在520 nm處的吸光度與其濃度的線性關系良好。范霞等[19]用分光光度法測定了烏龍茶中GABA的含量，結果表明，利用丙酮和AlCl3能有效去除藤茶中的色素，準確測定藤茶中GABA的含量。但是，目前報道的方法普遍存在操作繁瑣、前處理過程復雜和需要使用有毒有害試劑等問題，如GABA需與顯色劑反應后，才能被檢測器檢測等。因此，建立一種簡單、快速、準確、高效的茶葉中GABA定量分析方法具有重要的現實意義。

實時直接分析（DART）離子源是一種非表面接觸的常壓電離技術，是目前發展較成熟的大氣壓電離技術，也是生化分析中常用的方法[20，21]。該方法的特點是樣品無需復雜的前處理過程，所需優化的參數少，因此大大簡化了實驗步驟，縮短了分析時間; 在開放環境下進行分析，檢測方便快捷; 利用高能氣體作為電離試劑，無需特定溶劑; 無記憶效應，避免了實驗數據之間的相互影響。此外，還具有離子化效率高、抗干擾能力強、靈敏度高等優點，因此，在醫藥、食品、農藥殘留分析等領域得到了廣泛應用[22，23]。同時，DART離子源還可直接對固體、液體和氣體狀態的物質直接進行快速分析[24，25]?；贒ART離子源的以上優點，本研究建立了DART-MS法測定不同茶葉中GABA含量的方法，為快速篩選具有高含量GABA的茶葉品種提供了方便快捷的方法。為了驗證本方法的可靠性，將本方法測得的結果與采用2，4-二硝基氟苯進行柱前衍生化HPLC傳統檢測方法[26]的結果進行了比較，兩者一致性良好。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

TSQ Quantum Access MAX三重四極桿液相色譜-質譜聯用儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），配DART SVP離子源; 樣品傳動軌道（美國Parker Hannifin公司）; DIP-it Samplers（美國IonSense公司）; 隔膜泵（德國Vacuubrand公司）; GENIUS-NM32LA氮氣發生器（英國Peak Scientific公司）; Waters Alliance 2695 HPLC（配Waters 2475多波長熒光檢測器）和Empower 2色譜工作站（美國Waters公司）; MS205DU分析天平（瑞士Mettler Toledo精密儀器有限公司）; Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）; Puluerisette14粉碎機（德國Fritsch儀器設備有限公司）; SHZ-D型循環水真空泵（鞏義市予華器設備有限公司）; KH-700DE 型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）; WGL-230B電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）; QHZ-98A 全溫振蕩培養箱（太倉華大實驗儀器科技有限公司）。

10種茶葉品種分別為： 金駿眉（福建省南平市武夷山）、祁門紅茶（安徽祁門）、九香翠芽（江蘇宜興）、五洲山綠茶（江蘇鎮江五洲山）、桑葉茶（江蘇鎮江）、茉莉花茶（浙江杭州）、龍井綠茶（浙江杭州）、信陽毛峰（河南信陽）、信陽毛尖（河南信陽）和日照綠茶（江北無公害綠茶基地）。

GABA標準品（≥ 98%，北京世紀奧科生物技術有限公司）; NaHCO3、2，4-二硝基氟苯（FDBN）、乙酸鈉、冰醋酸、KH2PO4（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）; 甲醇、四氫呋喃（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）; 高純氬氣、氮氣（純度99.999%，蘇州金宏氣體股份有限公司）。

2.2?樣品制備方法

2.2.1?茶葉樣品預處理?將茶葉晾干，放入電熱鼓風干燥箱中，在80℃下烘干至恒重，用粉碎機粉碎，過40目篩后，于20℃貯藏，備用。

3.4?DART-MS法測定不同茶葉提取液中的 GABA含量

3.4.1?標準曲線?取適量GABA標準儲備液，用超純水稀釋得到一系列濃度梯度的標準溶液，采用DART-MS法進行測定。以GABA的DART-MS峰面積作為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，GABA濃度在2.5～40.0 μg/mL范圍內，DART-MS峰面積與濃度之間有很好的線性關系，標準曲線方程為y=1.36×107x-1.29×107（R2=0.998）。同時，以GABA標準溶液的HPLC峰面積作為縱坐標，溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，GABA濃度在2.0～48.0 μg/mL范圍內，峰面積與濃度之間有良好的線性關系，標準曲線方程為y = 3.87×106x-1.69×106 （R2=0.995）。

3.4.2?DART-MS精密度實驗?分別制備含GABA高（4.03 μg/mL）、中（2.02 μg/mL）、低（1.01 μg/mL）3種濃度的茶葉提取液（信陽毛尖），每種濃度3份，每份進樣8 針，進行DART-MS測定，計算每份 8 針的峰面積平均值，以及 3份平均峰面積的RSD，所得3個濃度水平樣品的結果的精密度分別為2.1%、3.6%和2.8%，表明DART-MS方法的精密度良好。

3.4.3?HPLC精密度實驗?分別制備含GABA高（3.92 μg/mL）、中（1.96 μg/mL）、低（0.98 μg/mL）3種濃度的茶葉提取液（信陽毛尖），按2.2.5節的步驟進行衍生化處理，每種濃度3份，計算3份峰面積的RSD，所得3種濃度樣品精密度分別為2.0%、2.6%和2.9%，表明HPLC方法精密度良好。

3.4.4?加標回收實驗?為確保實驗數據的準確性和可行性，采用HPLC法和DART-MS法分別進行加標回收實驗。平行取3份茶葉（信陽毛尖）提取液，分別加入 5.00、10.00 和15.00 μg/mL GABA標準溶液，樣品與加入的標準溶液體積相等，結果見表1。實驗結果表明，HPLC法測定的樣品加標回收率為91.6%～103.2%; DART-MS法樣品加標回收率在85.4%～98.7%范圍內，表明DART-MS測定茶葉中GABA的回收率較好，可用于實際樣品測試。

3.5?不同茶葉提取液中GABA的含量測定

使用DART-MS和HPLC分別測定了10種不同茶葉提取液中的GABA含量。結果見圖5和表2。由圖5可見，傳統HPLC法測得的結果和DART-MS法測得的結果相近，具體結果見表2。不同茶葉中的GABA含量存在明顯差異，其中，九香翠芽的GABA含量最高，為227.2 μg/g; 其次是信陽毛尖，GABA含量為161.2 μg/g; GABA含量最低的是日照綠茶，為75.6 μg/g。不同茶葉品種中GABA含量的差異可能是由于茶葉的品種、所處的地理位置、氣候、濕度以及不同的加工處理方法等因素造成的。

4?結 論

利用DART-MS法測定了10種不同茶葉中的GABA含量。10種不同茶葉中GABA含量各不相同，由高到低依次為： 九香翠芽，信陽毛尖，茉莉花茶，桑葉茶，祁門紅茶，龍井綠茶，金駿眉，五洲山綠茶，信陽毛峰和日照綠茶。 其中，九香翠芽的GABA含量高達227.2 μg/g，而日照綠茶的GABA含量為75.6 μg/g。 采用DART-MS法所測得的GABA含量的精密度較好，測得的結果和傳統HPLC法測得的結果一致，表明本方法的準確性較好。與傳統的HPLC法相比，本方法前處理過程簡單，無需衍生化，分析時間短，靈敏度高，具有良好的實用性。本研究為茶葉中GABA的定性與定量測定提供了一種快速高效的方法，同時也為測定茶葉中其它種類氨基酸的分析檢測提供了參考。

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