miRNA對畜禽脂肪沉積的影響及在遺傳育種中的應用

李心語 安清明 王大會

摘要：畜禽基因與其性狀的關聯(lián)研究較為廣泛，具有編碼效應的DNA和RNA對性狀有重要影響，非編碼RNA中的miRNA可以通過影響mRNA的翻譯而對畜禽的性狀產生特定影響。總結了miRNA在畜禽脂肪代謝中的研究進展，以期為今后進一步研究畜禽脂肪組織中miRNA的表達和功能提供參考。

關鍵詞：miRNA;脂肪沉積;畜禽;育種

Abstract： The association between genes and characters of livestock and poultry was widely studied. DNA and RNA with coding effect have important effects on traits. In addition， miRNA in non-coding RNA can have a specific effect on livestock and poultry traits by affecting the translation of mRNA. The research of miRNA in fat metabolism of livestock and poultry was summarized， in order to provide reference for further research on the description and functions of miRNA in fat tissue of livestock and poultry.

Key words： miRNA; fat deposition; livestock and poultry; breeding

在動物的生長過程中，除了肌肉的增長，還有脂肪的沉積，脂肪沉積是動物體脂肪合成與分解兩個過程協(xié)調作用的復雜生化過程，受多種因素影響。在動物成年后，皮下、肌肉和內臟都易沉積更多脂肪，而大量脂肪的沉積可能會對動物的某些性狀及生理過程產生不利影響。評價畜禽肉品質的重要指標之一為胴體皮下和肌內脂肪的含量。由于皮下脂肪較胴體肌內脂肪更易沉積，其結果往往會導致肌內脂肪儲備相對缺乏而皮下脂肪過多，這被認為是畜禽高品質肉質生產的主要障礙之一。近年來，科研工作者運用高通量測序技術不斷研究畜禽脂肪組織中含有的miRNA，并對其作用和影響進行探索，證實了miRNA在畜禽的脂肪沉積與代謝、脂肪細胞的分化、脂肪細胞的增殖等生理過程中都起關鍵作用。

1 miRNA簡介

microRNAs（miRNAs）是由長度為20～25個核苷酸組成的一類內源性且具有一定調控作用的非編碼小RNA，成熟的miRNAs是將初級miRNAs轉錄物通過特定核酸酶的剪切加工而形成的，其隨后會組裝進RNA誘導的沉默復合體，并通過使目標mRNA失去穩(wěn)定性而發(fā)揮作用。大量研究表明miRNA可參與血管發(fā)生、脂肪分解與沉積、細胞增殖分化與凋亡等多個重要的生命過程，故關于? ?miRNA的研究普遍涉及動植物生長發(fā)育、內源激素分泌及疾病發(fā)生等一系列重要的生命活動。

2 miRNA對畜禽脂肪沉積的影響

2.1 miRNA在牛脂肪組織中的相關研究

Li等[1]在研究miR-21-3p是否可以調節(jié)奶牛乳腺上皮組織細胞（BMECs）中甘油三酯產生的試驗中，用生物信息學方法推測miR-21-3p的靶基因，并發(fā)現BMECs中存在一種可以催化長鏈PUFAs反應的限速酶Elovl5，Elovl5是調控脂質代謝的重要基因。經生物信息學及雙熒光素酶報告分析證實Elovl5的3′UTR端中確實存在miR-21-3p靶點。經后續(xù)轉染試驗發(fā)現，在轉染miR-21-3p模擬物的BMECs中，甘油三酯含量被上調。同時，轉染miR-21-3p抑制劑的BMECs中甘油三酯含量被下調，因此推測miR-21-3p通過靶向調控Elovl5來調控脂質代謝。Zhang等[2]通過比較轉錄組分析去勢雄牛與未去勢雄牛在相同情況下肌肉內脂肪（IMF）增加情況，發(fā)現IMF增加與miR-224和LPL基因表達異常有關，并預測miR-224可能靶向調控LPL基因的表達。用雙熒光素酶報告基因試驗分析轉染了miR-224和LPL的293T細胞，證明了miR-224與LPL之間確實存在負向調控關系，且在LPL的3′UTR區(qū)域內有兩個miR-224的結合位點，得出miR-224可通過靶向調控LPL基因來影響牛前脂肪細胞的成脂分化。此前，miR-454被廣泛報道可參與細胞增殖、凋亡和癌癥的發(fā)生發(fā)展，而Zhang等[3]通過一系列試驗證實了miR-454可以與奶牛乳腺上皮細胞（BMECs）中的PPAR-γ（脂肪細胞形成的主要調節(jié)器）的3′UTR靶位點特異性結合，過表達的miRNA-454會使PPAR-γ的表達下調，會降低脂滴的積累和甘油三酯的產生，即miR-454負向調控牛乳腺上皮細胞PPAR-γ基因的表達來進一步調控脂肪細胞的生成。Ma等[4]發(fā)現bta-miR-130a和bta-miR-130b可以與其靶基因PPARG和CYP2U1的3′UTR端結合。bta-miR-130a/b被認為是脂肪細胞分化的負調控因子，它的表達會抑制脂肪調控基因PPARG的表達，而促進CYP2U1的表達，從而對肉牛脂肪細胞的增殖分化起調控作用。邵靜等[5]以延邊黃牛為研究對象，對閹牛和公牛背最長肌組織中存在表達差異的基因和miRNA進行分析，并經qRT-PCR技術驗證，得出miR-27可以通過調控ABAT、ATP6V0D2等基因來參與肌肉組織中糖、脂肪、蛋白質和能量等物質代謝途徑來調控脂肪代謝。除此之外， miR-27也被證實可以與奶牛乳腺上皮細胞（BMECs）中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）靶向結合，從而對奶牛乳腺上皮細胞中脂肪的合成起潛在調控作用[6]。Wang等[7]基于EST（表達序列標記）和GSS（基因組調查序列）以及牛保守miRNA的聯(lián)合檢測方法，發(fā)現miR-143、miR-145、miR-2325c 和 miR-2361在牛肌肉和皮下脂肪中有較高的表達，且4種miRNA在肌肉和皮下脂肪中的差異表達主要通過MAPK信號通路、WNT信號通路和TGF信號通路3種途徑來發(fā)揮作用。Sun等[8]在對不同發(fā)育階段（胎牛、成年牛）的牛背部脂肪中存在表達差異的miRNA進行試驗分析時，發(fā)現bta-miRNAn25 和 bta-miRNAn26在牛背部脂肪組織中有明顯的表達差異，表明它們可能會在牛的脂肪組織生長發(fā)育過程中起關鍵作用，并且推測其可能是遺傳學和育種的潛在分子標記物。

2.2 miRNA在羊脂肪組織中的相關研究

Zhou 等[9]對比了綿羊肌肉組織中共815個miRNAs，其中539個miRNAs在哈薩克斯坦綿羊（KS）和西藏綿羊（TS）脂肪組織中均有表達，并且有179和97個miRNAs在KS和TS中是特異表達的。進一步研究發(fā)現miR-125a-5p是ESRRα的靶向調控序列，而ESRRα可以抑制前脂肪細胞的分化。Pan等[10]通過對羊皮下脂肪組織塊進行試驗，得出miR-124-3p可以靶向結合C/EBPα mRNA的3′UTR的3個蛋白位點，直接抑制綿羊位于脂肪組織中具有脂肪生成能力基質血管部分（SVFs）的脂肪分化。Byrne等[11]通過對印記基因簇PEG11的研究發(fā)現，其可以編碼miR-431、miR-433、miR-136、miR-127和miR-432，且PEG11過表達會導致肌肉肥大，如果使miR-433和miR-431的表達同時上調，便會抑制脂肪的生成。Zhao等[12]從3日齡山羊頸皮下脂肪組織中分離出其前脂肪細胞進行試驗分析，得出miR-183可直接靶向Smad4的3′UTR，通過抑制Smad4而正向調控山羊脂肪細胞的脂肪生成，而Smad4的抑制表達顯著促進了山羊前脂肪細胞的分化。Ma等[13]發(fā)現miR-25的表達與泌乳量呈負相關，并確定miR-25可以與脂質生成的關鍵調控因子——過氧化物酶體增殖激活受體γ共激活因子1（PGC-1beta）3′UTR的3個特定位點靶向結合，而過表達的miR-25可導致PGC-1beta的表達受到抑制，進一步抑制某些脂肪基因的表達和甘油三酯的形成以及脂滴的積累。Chen等[14]發(fā)現miR-30e-5p和miR-15a在山羊乳腺上皮細胞（GMEC）中具有特異性表達。miR-30e-5p與miR-15a均可靶向結合LRP6，共同抑制LRP6的表達，促進GMEC中的脂肪代謝，并得出結論，miR-30e-5p和miR-15a通過影響LRP6和YAP1表達的途徑而協(xié)同調控山羊乳腺上皮細胞的脂肪酸代謝。Wang等[15]證明了miR-145可以直接靶向調控存在于山羊乳腺上皮細胞（GMEC）中的脂質相關基因啟動子INSIG1，這是存在于內質網上的一種跨膜（多面體）蛋白質，通過在內質網中保留SREBFs并阻止其在高爾基體中的蛋白質水解激活來調節(jié)脂質合成FA的過程，進而有效調控脂肪生成基因的表達，進一步調控GMEC中脂肪酸的合成和脂肪的沉積。

2.3 miRNA在豬脂肪組織中的相關研究

眾所周知，低睪酮水平會導致人類和動物的男性肥胖，即閹割會顯著地導致胴體脂肪的積累，這便是商業(yè)豬肉一般是采用閹割公豬的原因之一。Wang等[16]通過試驗解釋了此現象。通過對比去勢公豬與未去勢公豬的特點，發(fā)現在去勢豬的背部脂肪中MARK4蛋白質水平高于未去勢豬，且去勢公豬ssc-miR-7134-3p水平明顯低于未去勢公豬。進一步試驗發(fā)現ssc-miR-7134-3p可以靶向結合MARK4編碼序列（CDS）區(qū)域中的兩個特異位點，從而對MARK4的表達起負調控作用，而MARK4可能通過抑制p38MAPK磷酸化而促進去勢公豬的脂肪積累。Li等[17]通過對藏豬與大白豬肝臟的miRNA表達序列差異進行比較，發(fā)現共有6個存在表達差異的miRNA（miR-34a、miR-326、miR-1、miR-335、miR-185和miR-378），且其均可參與糖、脂質代謝。在西藏豬的肝臟中，低水平的miR-34a可能通過增加Sirtuin 1（Sirt1）型的表達而促進糖異生;低表達水平的miR-1可增加肝臟X受體α（LXRα）的表達，從而促進脂質的合成和積累;miR-185可以通過增加B類Ⅰ型“清道夫”受體（SR-BI）的表達，而促進血液中膽固醇的吸收和膽汁的分泌從而進一步影響脂肪沉積。Taniguchi等[18]通過用miR-33b轉染豬皮下脂肪前細胞（PSPA）觀察到脂肪分化延遲和脂肪積累減少的現象，即miR-33b可通過EBF1-C/EBPα和PPARγ通路而抑制脂肪合成基因的表達， 影響皮下前脂肪細胞（PSPA）的分化和發(fā)育，進而推遲脂肪分化并降低脂質沉積速度。Mentzel等[19]發(fā)現肥胖豬皮下脂肪組織中的miR-9和miR-124表達量高于普通水平且有顯著上調現象，推測miR-9和miR-124與脂肪細胞中脂質的沉積有關。Liu等[20]通過對原代豬前體細胞試驗，發(fā)現miR-375可以對豬前脂肪細胞內源性骨形態(tài)發(fā)生蛋白質受體（BMPR2）進行靶向調控，且沉默的BMPR2與過度表達的miR-375在脂肪的分化方面具有相同的抑制作用。其證明了miR-375是豬原代前體脂肪分化的負調節(jié)因子，并可對豬脂肪的分化產生影響。Ji等[21]在Solexa測序結果中發(fā)現miR-125a在成年豬背膘中表達較高。并且發(fā)現過表達的miR-125 a可以大大抑制脂肪生成標記物PPARγ、LPL、aP2基因的mRNA表達，并且還會通過影響目標基因ERRα的表達，導致脂質積累顯著減少。從而得出結論，ERRα可以在miR-125a的靶向調控下抑制豬前脂肪細胞的分化。Du等[22]發(fā)現在豬肌肉前脂肪細胞中存在兩個miR-125a-5p的靶基因。在脂肪細胞分化過程中，miR-125a-5p可與靶基因克虜伯類因子3（KLF13）的靶位點特異性結合，影響細胞分化;在豬肌肉內脂肪發(fā)生過程中可與特異性脂肪酸組成的調節(jié)因子脂肪酸延長酶6（ELOVL6）結合，調控脂肪生成。結果表明miR-125a-5p可能是一種新型的調控豬肌肉內脂肪生成和豬IMF脂肪酸組成的調控因子，且與豬肌內脂肪沉積呈負相關。Liu等[23]使用miRNA測序（miRNA-seq）技術分析了約克郡豬（YY，瘦肉型）和中國皖南花豬（WH，脂肪型）的背最長肌中的miRNA，發(fā)現miR-196a/b（miR-196a，miR-196b-5p）的表達差異明顯，且其在WH中表達量最高，故推測miR -196a/b可能通過刺激脂肪細胞因子信號通路，促進豬背最長肌組織的脂肪生成。

2.4 miRNA在禽類脂肪組織中的相關研究

邵芳等[24]利用生物信息學技術，篩選出了與脂質代謝有關且其3′端的2～8位可與miR-33完全互補的候選靶基因CHPT1，將miR-33過表達載體和CHPT1熒光素酶報告載體共轉染到小鼠的成肌細胞系C2C12中培養(yǎng)，發(fā)現如果miR-33與CHPT1的預測靶位點結合，則CHPT1基因的表達便會受到抑制，即得出miR-33可以通過對CHPT1基因的負調節(jié)作用來調節(jié)禽類脂質代謝。Liu等[25]發(fā)現鵝在短時間內過量攝入食物會導致嚴重的肝脂肪變性，通過進一步試驗發(fā)現，在肝臟、脂肪和肌肉中miR-29c的表達被全面抑制，為了驗證miR-29c的功能是否與鵝肝組織變性有關，預測了3個靶基因（即參與能量穩(wěn)態(tài)或細胞生長的Insig1、Sgk1和Col3a1）通過雙熒光報告系統(tǒng)等體外試驗對其進行驗證，最后得出miR-29c可能通過其靶基因調控能量穩(wěn)態(tài)和組織生長，促進鵝對嚴重肝脂肪變性的耐受，從而對脂肪的代謝與沉積產生影響。Zhang 等[26]在對雞進行與其肉質相關的miRNA分析試驗中，測量雞兩個不同生理階段的肌肉內脂肪（IMF）含量，整合分析miRNA-Seq和RNA-Seq數據，并建立雞肌內脂肪細胞分化模型。通過熒光素酶報告分析、miRNA過表達和油紅O染色試驗明確gga-miR-140-5p在肌內脂肪的靶點，且證明了gga-miR-140-5p能夠利用靶向類視黃醇X受體γ而促進肌內脂肪細胞分化。Fu等[27]對不同日齡的固始雞乳腺肌肉組織中存在顯著表達差異的miRNAs進行KEGG通路分析以顯示代謝途徑，并構建與乳腺肌肉發(fā)育和IMF沉積有關的miRNA-mRNA相互作用網絡，最終發(fā)現gga-miR-103-3p和gga-miR-138-2-3p可能對雞肌內脂肪的沉積起關鍵作用。

3 miRNA在畜禽遺傳育種方面的應用

畜禽的育種不僅可以根據其表觀性狀進行選育，其體內具有調控作用的基因更應該作為重要的參考。基因種類及表達水平的不同決定了性狀的不同。目前，已確定功能存在于畜禽的miRNA較多，這為畜禽的繁殖育種提供了重要的參考并奠定理論基礎。充分了解畜禽各組織器官中基因信號通路及生物學過程的調控機制，有助于了解畜禽性狀特點及規(guī)律。試驗證明多數miRNAs對畜禽的不同部位（如乳腺的上皮組織、肌內脂肪組織、皮下脂肪組織等）的脂肪代謝與沉積都有一定的調控作用。例如存在于奶牛的乳腺上皮細胞（BMECs）中的miR-21-3p、miR-454和miRNA-27;存在于羊乳腺上皮細胞（BMECs）中miR-30e-5p、miR-15a和miR-145都對乳腺中脂肪的代謝與沉積有不同的調控作用;存在于牛肌內脂肪的miR-224，存在于皮下脂肪的miR-143、miR-145、bta-miRNAn25和bta-miRNAn26等;存在于豬肌內脂肪細胞中的miR-125a-5p，和脂肪細胞中促進分化的miR-33b、miR‐375、miR-125a-5p等;調節(jié)禽類脂肪代謝的miR-33、gga-miR-103-3p和gga-miR-138-2-3p等，這些存在于畜禽脂肪中的miRNAs對于畜禽自身而言可以不同程度地調控其脂肪的分化與沉積，同時這些miRNAs也可以作為標記輔助因子，對優(yōu)質畜禽品種的選育及畜禽品種改良優(yōu)化都發(fā)揮重要的參考和指導作用。進一步了解這些特性miRNA背后的分子機制，將為優(yōu)化牛羊的乳質和畜禽的肉品質提供重要的思路，還有助于改善其泌乳性能并優(yōu)化其產肉性能。從整體來看，畜禽的miRNA研究為畜禽的遺傳選育提供了重要參考。

4 小結

關于機體組織miRNA種類和功能的檢測主要包括機體細胞的分離、體外細胞培養(yǎng)與分化、靶基因的預測、雙熒光素酶報告分析、油紅O染色、靶基因的轉染驗證試驗、實時定量熒光PCR和蛋白質免疫印跡分析及統(tǒng)計分析等基本步驟。由于miRNA功能的重要性及其檢測方法的普及性，目前，有關miRNA種類和性能的研究非常廣泛，機體組織中被證實功能的miRNA也層出不窮，不僅涉及植物病癥研究和性狀調控，也涉及動物研究，包括疾病原因的探討，機體皮毛、器官、肌肉、脂肪等生長的調控機制，產奶產蛋性能的調控，遺傳繁殖質量及數量的調控等。具有不同調控作用的miRNAs不僅可以作為動物體質評定及性能評定的有效依據，同時在育種工作方面也有重要指導作用。由于在不同種動物或同種動物的不同年齡階段以及同年齡階段但具有不同形態(tài)特征的同種動物，其機體內的miRNA種類或同種miRNA的表達都存在一定的差異，故miRNA的未知領域仍很寬廣，需科研工作者進一步發(fā)現與驗證。

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