烏梅有機酸提取條件優化及其對生物膜形成的抑制作用

薄曉瑋 楊志萍 綦國紅

摘要：對烏梅總有機酸的提取條件進行優化并研究其對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）生物膜產生的抑制作用。通過單因素試驗及正交試驗對烏梅總有機酸提取條件進行了優化及驗證，采用結晶紫染色法對金黃色葡萄球菌生物膜形成量進行了測定。結果表明，烏梅總有機酸最佳提取條件為乙醇70%（體積分數）、料液比3∶40（g∶mL）、超聲提取時間1.5 h及超聲提取溫度50 ℃。在該條件下，烏梅總有機酸提取率為24.50%。提取物濃度為0.5MIC、MIC和2MIC時，對金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制率分別為13.06%、48.24%和74.01%。因此，該提取物對金黃色葡萄球菌生物膜的形成具有抑制作用。

關鍵詞：烏梅;總有機酸;方法優化;金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）;生物膜

Abstract： The extraction conditions of total organic acid from Prunus mume was optimized and its inhibition on biofilm formation by Staphylococcus aureus was studied. The single factor and orthogonal test were used to optimize and verify the total organic acid extraction scheme of Prunus mume. The amount of biofilm formation by Staphylococcus aureus was determined by crystal violet staining. The results showed that the optimum extraction conditions of total organic acids were ethanol 70% （volume fraction）， solid-liquid ratio of 3 g / 40 mL， ultrasonic extraction time of 1.5 h and ultrasonic extraction temperature of 50 ℃. The extraction rate of total organic acid was 24.50% from Prunus mume under these conditions. The inhibitory rates on biofilm formation by Staphylococcus aureus was 13.06%，48.24% and 74.01% respectively at the extract concentration of 0.5MIC， MIC and 2MIC. Therefore， the extract could inhibit the formation of Staphylococcus aureus biofilm.

Key words： Prunus mume; total organic acid; method optimization; Staphylococcus aureus; biofilm

烏梅又稱酸梅、干枝梅，由薔薇科喬木植物梅（Prunus mume）的近成熟果加工處理所得。《本草綱目》及《本經》均有記載，烏梅的多數部分均可入藥，主要可治療呼吸系統疾病及胃腸道不適等。烏梅的化學成分復雜，主要包括有機酸、氨基酸、糖類及揮發油等[1]，豐富的化學組成賦予了烏梅多種功能。目前烏梅有機酸提取工藝以熱水浸提居多，提取時間長，提取率較低。超聲波在提取中的應用可以提高提取率，大大縮短提取時間。

細菌生物膜（Bacterial biofilm，BF）是細菌為自我防護而形成的膜狀結構，最大特點是粘附性強，難以清除，從而導致持續性污染，成為食品安全的一大隱患[2]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是造成人類食物中毒的常見致病菌，也可以引起人類和動物的化膿性感染，并具有很強的生物膜形成能力[3]。金黃色葡萄球菌作為第二大食源性疾病發病原因，對該菌有效控制具有非常重要的意義。本研究對烏梅總有機酸提取條件進行優化，并研究了該提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性和生物膜的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料和試劑

金黃色葡萄球菌保存于中國藥科大學食品質量與安全實驗室。

烏梅購于南京同和堂大藥房，60 ℃烘干至恒重，粉碎，過60目篩，-20 ℃密封保存備用。

胰蛋白胨（生物試劑），購自北京奧博星生物技術有限公司;結晶紫草酸銨染色液，永安化學實驗室出品;YEAST EXTRACT，購自Oxoid Ltd（UK）;酚酞，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

HZQ-F160全溫震蕩培養箱，蘇州培英實驗設備有限公司;UV-1800PC紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司;ELxTM800多功能酶標儀，美國博騰儀器有限公司;SB25-12DTD超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 烏梅總有機酸提取工藝流程 將一定質量的烏梅粉與不同體積分數的乙醇溶液置于50 mL錐形瓶中超聲，冷卻后離心（4 000 r/min、10 min），取上清液，旋轉蒸發得濃縮液，定容后即為待測液[4，5]。

1.3.2 烏梅總有機酸提取率的測定 按文獻[6]方法測定提取物中的有機酸，烏梅中的總有機酸含量以枸櫞酸（Mr=192）計。按下式計算烏梅總有機酸提取率。

[總有機酸提取率=cVNaOH×Mrm×3×1? 000×50×100%]? ? （1）

式（1）中，c為NaOH滴定液濃度，VNaOH為待滴定液消耗NaOH滴定液的體積，m為烏梅粉質量，3為枸櫞酸與NaOH反應系數，50為稀釋倍數。

1.3.3 烏梅總有機酸提取單因素試驗

1）乙醇體積分數對提取效果的影響。取3.0 g烏梅樣品，料液比為3∶40（g∶mL，下同），在45 ℃下水浴超聲2 h，測定乙醇體積分數分別為60%、65%、70%、75%、80%時烏梅總有機酸的提取率[4]。

2）料液比對提取效果的影響。取3.0 g烏梅樣品，在45 ℃下水浴超聲2 h，測定料液比分別為3∶30、3∶35、3∶40、3∶45、3∶50（g∶mL）時烏梅總有機酸的提取率[4，7]。

3）超聲時間對提取效果的影響。取3.0 g烏梅樣品，恒定乙醇體積分數以及料液比，在45 ℃下水浴超聲，測定超聲時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時烏梅總有機酸的提取率[4]。

4）超聲溫度對提取效果的影響。取3.0 g烏梅樣品，恒定乙醇體積分數、料液比和超聲時間，測定超聲溫度分別為35、40、45、50、55 ℃時烏梅總有機酸的提取率[4]。

1.3.4 烏梅總有機酸提取正交試驗 在4個單因素試驗結果的基礎上，從每個單因素的5個水平中選取3個較好水平進行試驗。以有機酸提取率為提取效果的衡量標準，采用4因素3水平的正交試驗，按照L9（34）標準正交表進行正交試驗設計，優化烏梅中有機酸的最佳提取條件[8，9]。

1.3.5 烏梅總有機酸提取工藝驗證試驗 按照正交試驗優化后的工藝條件進行提取并計算有機酸得率[8]。

1.3.6 烏梅提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用 依據正交試驗優化后的提取工藝進行提取，得100 mg/mL（以烏梅粉計）提取物，-20 ℃密封保存備用。

1）最低抑菌濃度（MIC）的測定。LB培養基滅菌后接種，加入提取液，使其終質量濃度分別為1.50、2.00、2.50 mg/mL，37 ℃ 150 r/min振蕩培養24 h，觀察金黃色葡萄球菌的生長情況。無菌生長的最低濃度組所對應的濃度即為MIC[3]。

2）對金黃色葡萄球菌生長的影響。LB培養基滅菌后接種，并加入提取物，使其終濃度為0.5MIC、MIC、2MIC，并設置空白對照組。37 ℃ 150 r/min振蕩培養，分別在0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h時測定其A600 nm的值，繪制生長曲線。

1.3.7 對金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用 培養基滅菌后加入5 mm×5 mm無菌輸液管片，并加入提取物，使其濃度為0.5MIC、MIC、2MIC，并設置空白對照組，待冷卻后接種菌懸液。37 ℃靜置培養24 h，取出輸液管片，無菌水沖洗，45 ℃干燥30 min，0.2%結晶紫染色3 min，無菌水沖洗其表面殘余的結晶紫，45 ℃干燥30 min，放入96孔板，加入200 μL無水乙醇洗脫5 min，酶標儀570 nm測定洗脫液的吸光度值。按下式計算抑制率[2]。

[抑制率=A0-A1A0×100%]? （2）式（2）中，A0為空白組吸光度值，A1為實驗組吸光度值。

2 結果與分析

2.1 烏梅總有機酸提取單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數的確定 由圖1可知，在乙醇體積分數為60%～65%時，烏梅總有機酸提取率呈上升趨勢，且在乙醇體積分數為65%時提取率達到最高;但當乙醇體積分數大于65%時，烏梅總有機酸的提取率呈下降趨勢。一方面可能與有機溶劑所具有的氫鍵的斷裂有關，有機酸在植物體內與蛋白質、多糖等物質的連接方式常以氫鍵為主，因此復合體系有利于有機酸的提取;另一方面可能是乙醇分子與水分子之間作用力不同而造成提取出的主要有機酸不同，因而引起提取率下降。因此，選擇體積分數為65%的乙醇溶液作為提取溶劑。

2.1.2 料液比的確定 由圖2可知，在料液比為? ? ?3∶30～3∶35時，烏梅總有機酸提取率呈上升趨勢。但在料液比3∶35～3∶45波動較小，當料液比大于? ? 3∶45時，提取率呈下降趨勢。當提取溶劑過少時，固液兩相濃度梯度小，使固相中的有機酸物質不能完全溶出;而溶劑過多則有可能影響到超聲波粉碎的效率，從而影響提取率。此外，料液比增大也會使旋轉蒸發的時間延長。因此，選擇料液比為3∶40。

2.1.3 超聲提取時間的確定 由圖3可知，在超聲提取時間為1.0～1.5 h時，烏梅總有機酸提取率呈上升趨勢，并在1.5 h處達到最大;在1.5～3.0 h時先下降而后趨于穩定。隨著提取時間的延長，烏梅總有機酸的提取率應持續上升，但是在提取過程中可能會有空氣進入提取液，進入的O2可能與有機酸發生一系列氧化、聚合等反應，導致烏梅總有機酸提取率下降。在實際生產中，提取時間的延長會導致生產成本增加。因此，選擇最佳超聲提取時間為1.5 h。

2.1.4 超聲提取溫度的確定 由圖4可知，在超聲提取溫度為35～45 ℃時，烏梅總有機酸提取率呈上升趨勢，并在45 ℃處達到最大值;溫度大于45 ℃時呈下降趨勢。隨著水浴溫度的上升，分子熱運動加快，在溫度較低范圍內升溫時，烏梅總有機酸提取率隨溫度升高而升高;但可能烏梅中的某些有機酸熱穩定性較差，當溫度超過45 ℃時，受熱分解，導致烏梅總有機酸提取率下降。因此，選擇最佳超聲提取溫度為45 ℃。

2.2 正交試驗與結果

根據單因素試驗結果，以總有機酸提取率為主要考察指標，采用L9（34）正交試驗研究乙醇體積分數（A）、料液比（B）、超聲提取時間（C）和超聲提取溫度（D）對烏梅總有機酸提取率的影響。

根據4個單因素試驗的結果，設計了表1所示的正交試驗因素與水平，其試驗結果見表2。

根據表2中R（極差）分析可知，本試驗所考察的影響烏梅總有機酸提取率的4個因素中，料液比（B）和超聲提取時間（C）2個因素的影響較為顯著，4個影響因素按照顯著性從高到低依次排列為超聲提取時間（C）>料液比（B）>乙醇體積分數（A）>超聲提取溫度（D）。

根據正交試驗可知，烏梅中總有機酸提取的最佳條件為A3B2C2D3，即提取劑為70%乙醇溶液（體積分數）、料液比為3∶40、超聲提取時間為1.5 h、超聲提取溫度為50 ℃。

2.3 驗證試驗結果

按照正交試驗所確定的最佳提取工藝參數，使用提取劑為70%乙醇溶液（體積分數），料液比為3∶40（g∶mL），超聲提取時間為1.5 h，超聲提取溫度為50 ℃，進行3次平行驗證試驗。結果表明，烏梅總有機酸提取率分別為24.43%、24.53%和24.53%，平均為24.50%，計算其相對標準偏差（RSD）結果為0.24%，表明利用正交試驗對烏梅總有機酸的醇提工藝進行優化是有效的。

2.4 對金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度（MIC）

由表3可知，烏梅醇提取物MIC值為2.50 mg/mL。

2.5 對金黃色葡萄球菌生長的影響

由圖5可知，0.5 MIC（1.25 mg/mL）組在0～2 h生長速度趨近于空白組，但在2～12 h的生長速率與空白組有較為明顯的差異，但其吸光度值在12 h時與空白組幾乎無差別，并在24 h之后與空白組一樣進入衰退期。MIC（2.50 mg/mL）組在12 h之前均處于緩慢生長狀態，在12 h左右進入快速生長期，并在24 h時達到最高點。0.5 MIC組與MIC組隨著培養時間的延長，抑菌物質被消耗，菌數趨同。由此上述2個濃度組的提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用表現在生長初期和進入對數生長期的時間被推遲及菌數所能達到的最大值降低，其抑菌作用在不同階段呈現出不同的特性。2MIC組在0～48 h內細菌生長基本處于停滯狀態。

2.6 對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響

由圖6可知，烏梅醇提取物對金黃色葡萄球菌生物膜的形成具有較為強烈的抑制作用，且其抑制程度隨提取物濃度的增大而加強，提取物濃度為0.5MIC、MIC和2MIC時，金黃色葡萄球菌生物膜的抑制率分別為13.06%、48.24%和74.01%。

3 小結

通過單因素試驗和正交試驗，對超聲法醇提烏梅總有機酸的工藝條件進行了優化，獲得最佳提取條件為提取劑70%乙醇溶液（體積分數）、料液比? ?3∶40（g∶mL）、超聲提取時間1.5 h、超聲溫度50 ℃。對該優化工藝條件進行驗證，烏梅總有機酸提取率達24.50%，提取率較高，且提取時間短。抑菌試驗結果顯示，烏梅提取液對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為2.50 mg/mL。提取物濃度在0.5MIC、MIC和2MIC時對金黃色葡萄球菌生物膜產生的抑制率分別為13.06%、48.24%和74.01%，生物膜抑制率隨著提取物濃度的升高而增大。因此該提取物對金黃色葡萄球菌生物膜的形成具有明顯的抑制作用。

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