微藻育種的研究進展

單曉慧　王瑤　趙東升

摘要 ? ?微藻作為一種單細胞光合自養生物，在海洋中廣泛存在。近年來，微藻在食品、藥品和生物能源等方面都受到重視。為了得到優良性狀的微藻，需要對微藻育種技術進行探究。本文概述了幾種微藻育種方法，總結了各方法的優缺點以及研究進展，以期為微藻育種的后續研究提供參考。

關鍵詞 ? ?微藻;育種;技術

中圖分類號 ? ?Q949.2 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）16-0142-02

Research ?Progress ?on ?Microalgae ?Breeding

SHAN Xiao-hui ? ?WANG Yao ? ?ZHAO Dong-sheng

（School of Life and Environmental Sciences， Wenzhou University， Wenzhou Zhejiang 325035）

Abstract ? ?As a kind of unicellular photosynthetic autotrophic organisms， microalgae exist widely in the ocean. In recent years， microalgae have been valued in food， medicine and bioenergy. In order to obtain microalgae with excellent traits， it is necessary to explore microalgae breeding technology. The advantages and disadvantages of various methods and research progress was summarized， so as to provide a reference for the follow-up research of microalgae breeding.

Key words ? ?microalgae; breeding; technology

微藻是真核生物的最簡單形式，具有數量龐大，生長速度快、適應性強的特點，作為初級生產者，能高效率地進行光合作用并釋放氧氣[1]。同時，微藻在進化上具有多源性以及遺傳多樣性，能夠產生多種次級代謝產物，如不飽和脂肪酸、藻膽蛋白、蝦青素等生物活性物質[2-3]。但是，能進行規模養殖的微藻種類不多，微藻的產業化發展存在諸多困難。因此，選擇具有優良性狀的藻種并將生物技術與傳統育種技術結合，是促進微藻開發和利用的重要途徑。

1 ? ?選擇育種

作為基礎育種方法，采用自然分離的選擇育種法操作簡單直接，缺點是費時、遺傳性狀不穩定等[4]。選擇育種的方法包括稱重法、平板劃線法、稀釋法、微吸管法和96孔板法等。

稱重法最早是Folch等[5]為了分離和純化動物組織的總脂而采用的方法。隨后，Baldoni等[6]對此方法進行優化，可以快速從組織中提取非極性脂質。Moazami等[7]應用此方法對從波斯灣和克什姆島采集的147種微藻進行了篩選，得到2株高油脂含量的微藻。譚桂英等[8]利用逐級稀釋法從鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）中分離得到了6個不同形態的藻株，并從中篩選出一株生長速度快以及蛋白含量高的藻株。張 ?東等[9]通過96孔板法從天然海水中分離純化出一株海洋硅藻，并從形態學和分子生物學兩方面研究發現其屬于微型角毛藻新種[9]。

流式細胞儀分選和微孔板技術是微藻育種的新興技術，Pereira等[10]將熒光活化細胞分選系統（FACS）與微孔板技術相結合，對環境樣品中富含脂質的微藻進行分離，通過FACS直接分選到固體培養基中的擴大培養過程較液體培養大約節約了3周時間。

選擇育種法獲得的微藻藻株發生變異的幾率小，對生物環境以及人類生活不會帶來危害，是一種常用的藻種選育方法。

2 ? ?誘變育種

天然存在的突變體是由環境效應物，如紫外線輻射或代謝產生的活性氧物質等，與遺傳物質之間相互作用產生的，其產生的突變是遺傳變異的主要來源，具有進化的潛力[11]。但是，自然誘變過程太慢，無法立即應用于育種或研究[12]。

2.1 ? ?物理誘變育種

典型的物理誘變劑包括紫外線、伽馬射線或重離子束等。每種類型的輻射對細胞的作用方式和誘變潛力取決于各輻射的能量，而它們的使用頻率則取決于是否易于操作[13]。

紫外線誘變育種簡單且容易操作，不需要專門的設備以及化學藥品，是通過將細胞暴露在無菌環境中的殺菌紫外線燈下進行的。Neupert等[4]利用紫外線對單細胞綠藻萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）進行誘變，從而分離得到高轉基因表達的藻株。Jaeger等[15]將斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）用紫外線照射后獲得3 500多個突變藻株，并從中成功分離出5個無淀粉突變體，均可產生更多的三酰基甘油（triacylglycerol，TAG）。

伽馬射線，特別是重離子束輻射需要專用的設備，因而沒有得到廣泛使用。但Yoon等[16]通過使用不同劑量的伽馬射線輻照不同的微藻，突變藻株的油脂含量提高了1.4倍。有人對擬球藻（Nannochloropsis）進行重離子輻照，與野生型相比，突變株的油脂含量增加了28 %，而極性脂質減少了15%，它可以作為微藻生產生物柴油有價值的候選者[16]。

2.2 ? ?化學誘變育種

化學誘變是利用一些能導致遺傳物質改變的誘變劑，其中使用最廣泛的是烷基化試劑，例如甲烷磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）和甲硝基亞硝胍（1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine，MNNG）。Chaturvedi等[17]用EMS對擬球藻進行誘變后得到抗淺藍菌素以及抗紅霉素的突變藻株，與野生型相比，所含有的二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）分別增加了29%和12%。Lian等[18]用MNNG對裂壺藻（Schizochytrium）進行誘變后獲得突變藻株的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性比親本藻株高，從而能產生更多NADPH，該突變藻株中二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）的含量占總脂肪酸的56.22%，比親本藻株高17.34%。Ong等[19]用EMS對小球藻（Chlorella）進行誘變后得到2個耐熱突變藻株，野生型小球藻生長的最佳溫度是25 ℃，而耐熱突變藻株在40 ℃的環境中依然能夠生長。此外，還有一些天然堿基類似物、亞硝基化合物和疊氮化物等也可作為化學誘變劑[20]。

各種誘變方法的特點不同，在一定劑量以及篩選方法的配合下篩選得到所需的突變藻株，對環境的污染較小，但存在的表型性狀不穩定的現象也會對以后的生產產生影響。

3 ? ?基因工程

基因工程育種具有針對性強、穩定性強的特點。近年來，微藻的基因工程研究發展迅速，是很多課題組積極研究的方向。隨著各種微藻基因組信息的公布，使得微藻的遺傳轉化體系逐漸完善，比如在三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）[21]、小球藻[22]以及杜氏鹽藻（Dunaliella salina）[23]等微藻中進行遺傳轉化，運用基因敲除和基因沉默的方法實現微藻的基因工程改造，獲得所需要的性狀。Kilian等[24]將微擬球藻（Nannochloropsis sp.）中編碼硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶的基因敲除后，其在硝酸鹽以及亞硝酸鹽的培養基上不能生長。此外，Nymark等[25]和Shin等[26]分別利用CRISPR/Cas9技術對萊茵衣藻和三角褐指藻中的基因進行靶向編輯，從而實現更為準確的基因改造。一些像Algal Functional Annotation Tool，GreenCut2和AlgaGEM等與微藻相關的生物信息學平臺的發展[27]，為微藻的相關基因和蛋白質組學的研究提供注釋，也為微藻的遺傳改造提供了基礎。

基因工程育種取得了很大的進展，但在培養的安全性以及外源基因的表達效率等方面依然存在一些問題。隨著對微藻遺傳特性研究的發展，基因工程育種仍然是一種重要的育種手段。

4 ? ?細胞融合

細胞融合是在外力作用下將2個細胞的原生質體融合成為雜交的細胞，從而具有新的遺傳學特征，其育種周期短且極易產生變異，但變異并不穩定[28]。1957年，日本微生物研究所首次發現仙臺病毒能使相鄰的2個細胞融合在一起，此后，細胞融合技術開始應用于育種當中[29]。細胞融合在微藻育種方面也有了發展，Tjahjono等[30]用3種除草劑對雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）進行誘變得到3組抗性突變體，將任意2組突變體進行原生質體融合后，融合藻株合成類胡蘿卜素的能力較親本高3倍左右。沈繼紅等[31]利用細胞化學融合法，將高產EPA和DHA的自養微藻（綠色巴夫藻）與生長迅速的兼養微藻（四鞭藻）進行融合，篩選獲得融合藻株，發現其總脂含量以及EPA/DHA等各項指標均有較大提高。

細胞融合育種克服了遠緣雜交的困難，拓展了育種的領域，實現了遺傳重組，隨著原生質體的制備方法和微藻遺傳學的研究深入，細胞融合育種技術將會有進一步的發展。

5 ? ?參考文獻

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作者簡介 ? 單曉慧（1992-），女，山東青島人，在讀碩士研究生。研究方向：藻類次生代謝與調控。

收稿日期 ? 2020-04-20