甲醇濃度對畢赤酵母發酵表達重組人Ⅲ型膠原蛋白的影響#

梁鑫 梁波 張仁懷 呂自力 艾華偉 鄭飛 單旭東 陳浩然

（1. 成都中醫藥大學醫學與生命科學學院/附屬生殖婦幼醫院，四川 成都 610041；2. 四川省人口和計劃生育科學研究所，四川 成都 610041；3. 成都遠睿生物技術有限公司，四川 成都 610000；4. 河南多美康生物藥業有限公司，河南 鄭州 450000）

膠原蛋白是結締組織中最主要的結構蛋白， 對維護細胞、組織和器官的正常生理功能具有十分顯著的作用[1-4]。膠原蛋白具有多種生物活性，參與細胞的遷移、分化和增殖，同時其抗原性弱，生物相容性良好，在燒創傷的治療，創面止血、骨質疏松、眼角膜疾病等的治療以及人造代血漿等醫藥衛生領域皆有廣泛的用途[5-9]。因此，近年來，膠原蛋白作為人體含量最多、最豐富的天然蛋白質，在營養、保健和醫藥等領域的應用價值被越來越多的消費者所認可[10]。

目前已發現的膠原包括27種，其中在真皮中分布最為廣泛的是I、Ⅲ型膠原[1,11]。成人皮膚中I型膠原約占80%，Ⅲ型約占20%，而胎兒和嬰兒皮膚中約60%的膠原為Ⅲ型。I型膠原在體內構成有橫紋的粗徑原纖維，是瘢痕組織纖維化的物質基礎，在愈合的傷口中大量存在，使傷口處皮膚質地堅硬而沒有彈性。而Ⅲ型膠原蛋白則是皮膚中網狀纖維的主要組成部分，其含量越高則纖維束越細。在創傷修復中，Ⅲ型膠原的比例高則創口皮膚細膩柔滑。Ⅲ型膠原蛋白也是嬰兒皮膚無瘢痕愈合的原因之一。

以傳統酸、堿、酶水解法從動物組織中提取膠原蛋白，易導致蛋白生物功效降低、臨床不穩定和病毒隱患等問題。相較于傳統的動物來源膠原蛋白，重組人Ⅲ型膠原蛋白具有更強的生物學活性、親水性和可加工性，以及更低的免疫原性[12-15]。表達重組膠原蛋白的常用宿主有酵母、大腸桿菌、哺乳動物細胞、轉基因煙草、昆蟲細胞等[16-18]。利用基因工程技術，通過酵母分泌表達Ⅲ型膠原蛋白，具備產量高、質量穩定可控、產品無免疫排斥和過敏反應等優勢[19-23]。本研究中，我們通過優化甲醇濃度對重組畢赤酵母菌株進行發酵研究，達到提高重組人Ⅲ型膠原蛋白產量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

重組畢赤酵母GS115基因工程菌由本研究團隊構建，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.12491。

1.1.2 培養基

YPD培養基（每升）：10 g酵母提取物，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖。

PTM微量元素（每升）：CuSO4·5H2O 6 g，NaI 0.08 g，MnSO4·H2O 3.0 g，Na2MoO4·2H2O 0.2 g，H3BO30.02 g，CoCl20.5 g，ZnCl220 g，FeSO4·7H2O 65 g，生物素 0.2 g，H2SO45 ml，用0.22 μm濾膜過濾除菌，室溫保存。

分批發酵培養基 (升)：MgSO4·7H2O 14.9 g，H3PO426.7 ml，CaSO40.93g，K2SO418.2g，，KOH 4.13 g，甘油 40 g；滅菌后再加入4 ml PTM微量元素。補料生長培養基：50%（W/V）甘油（含PTM 12 ml?L-1）。

發酵誘導培養基：甲醇（含PTM 12 ml?L-1）。

1.1.3 設備

柚子。柚子營養豐富，含有糖類、有機酸、維生素A、B1、B2、C、P 和鈣、磷、鎂、鈉等營養成分。柚子還含有生理活物質皮甙以及類胰島素，柚肉中所含維生素C非常豐富，故柚肉能降血脂、降低血液黏滯度，減少血栓形成，有防治腦血管疾病等功效。

15 L發酵罐（上海百倫生物科技有限公司），臥式恒溫振蕩器（美國精騏有限公司），生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司），紫外分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）立式壓力蒸汽滅菌器（上海申宏醫療器械廠），高速冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司），電泳儀（BIO-RAD公司），Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養方法

一級種子：從-80℃冰箱，取出工作種子，按1:1000（V/V）接種至一級YPD培養基，28℃，搖床轉速200 rpm，培養40 h左右，當OD600達到10-15左右，轉接下一級種子培養基。

二級種子：按2%-5%（V/V）比例，將一級種子轉入二級YPD培養基，28℃，轉速200 rpm，培養24 h左右，OD600達到15-20左右，轉接發酵罐。

三級發酵：二級種子按1:10比例接入10L發酵罐中發酵培養，設定pH為5.0，攪拌轉速為600 rpm，溫度為28℃。后期發酵采用以下兩種策略。

（1）參照Invitrogen 公司方法[24]進行甲醇流加，保持溶氧在10%左右；

（2）采用兩階段發酵法，第一階段通過補加甘油增加重組酵母菌的生物量，第二階段，加入甲醇進行重組人Ⅲ型膠原蛋白的誘導表達。培養至溶氧上升時，以流速為250 mL?h-1開始流加50%的甘油，持續流加4 h，菌體濕重達到120-130 g?L-1停止加入甘油。待溶氧上升100%后饑餓培養0.5 h，之后開始流加甲醇，誘導重組人Ⅲ型膠原蛋白表達約72 h。加入甲醇時，維持發酵液中甲醇濃度分別在0.05%、0.1%、0.2%、0.4%，保持溶氧在10%左右。

1.2.2 分析方法

對發酵液離心上清液中重組人Ⅲ型膠原蛋白進行SDS-PAGE電泳定性檢測，用分子排阻高效液相色譜（Size exclusion high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）分析重組人Ⅲ型膠原蛋白含量。

2 結果

2.1 根據溶氧控制甲醇流加

參照Invitrogen公司提供旳巴氏畢赤酵母發酵方案[24]，微生物發酵過程中，pH、溶氧（DO）等參數反映碳源的消耗情況。當碳源消耗完，DO會上升，如果再加入碳源，由于微生物利用碳源消耗氧，使DO下降。利用這個原理可根據DO的變化控制畢赤酵母發酵過程中甲醇的流加。重組人Ⅲ型膠原蛋白表達如圖1，生長曲線如圖2（DO）。

圖1 誘導時間電泳圖

從圖1電泳、圖2 DO生長曲線可以看出，用原始方案發酵，雖然菌體量達到0.4 g?mL-1，但重組人Ⅲ型膠原蛋白表達量只達到3 g?L-1，還達不到產業化的要求。在誘導時，補加的甘油已經消耗完，只加入甲醇補充碳源。

2.2 根據甲醇濃度控制甲醇流加

通過流加甲醇，保持甲醇濃度在0.05、0.1、0.2、0.4%（V/V）時，重組畢赤酵母菌的生長曲線見圖2，重組人Ⅲ型膠原蛋白表達情況見圖3。

從圖2的生長曲線看出，隨著甲醇濃度的增加菌體量有所提高，說明根據控制溶氧流加甲醇還不能滿足菌體的生長，碳源不足導致重組人Ⅲ型膠原蛋白表達量低；在甲醇濃度低的情況下，甲醇補充的碳源有利于菌的生長，甲醇濃度增大后，甲醇不利于菌的生長，當甲醇濃度達到0.4%時，菌體量開始下降，說明甲醇濃度大對菌的生長有抑制作用。

圖3顯示，隨著甲醇濃度增加，重組人Ⅲ型膠原蛋白表達量增加，但甲醇濃度增加到0.4%時，重組人Ⅲ型膠原蛋白出現大量降解，菌體量也出現下降。在甲醇濃度為0.2%時，重組人Ⅲ型膠原蛋白表達量達到最大值8 g?L-1，菌體量也達到0.45 g?mL-1。說明重組人Ⅲ型膠原蛋白的表達需要大量的甲醇補充碳源，但甲醇濃度不能大于0.4%。

圖2 不同甲醇濃度的生長曲線

圖3 不同濃度甲醇誘導重組人Ⅲ型膠原蛋白表達電泳圖

3 討論

參照Invitrogen公司提供的巴氏畢赤酵母發酵方案，在畢赤酵母誘導表達重組人Ⅲ型膠原蛋白的發酵過程中，根據溶養控制流加甲醇，不能有效地監控甲醇濃度，不能有效地提供菌體生長及表達重組人Ⅲ型膠原蛋白所需要的碳源。重組人Ⅲ型膠原蛋白表達量低，可能是誘導時碳源量不能滿足重組人Ⅲ型膠原蛋白表達所需要的營養，需要增加優化甲醇的補加量。

利用甲醇傳感器，在線檢測發酵液中甲醇濃度。由于該傳感器靈敏度高，響應時間短，因此能有效地控制甲醇的流加，使甲醇的濃度維持恒定。本研究結果表明，采用兩階段發酵法對重組畢赤酵母菌進行發酵，可以獲得重組人Ⅲ型膠原蛋白的高效表達。第一階段增加重組酵母菌的生物量，在培養至溶氧上升時，以流速為250 mL?h-1持續流加50%甘油4 h，菌體濕重達到120-130 g?L-1時停止加入甘油。第二階段，加入甲醇進行誘導表達，在加入甲醇的時候控制甲醇濃度在0.2%，菌體量可達0.45 g?mL-1，重組人Ⅲ型膠原蛋白表達量達到8 g?L-1。

通過重組畢赤酵母菌兩階段發酵法，并在誘導時準確控制甲醇濃度，能更準確穩定的控制發酵過程，提高重組人Ⅲ型膠原蛋白的表達量。本研究為重組人Ⅲ型膠原蛋白的產業化奠定了基礎。