引火湯改善長期OVX小鼠焦慮樣行為的機制研究

伊金月，張悅，邱琦，劉爽，關雨佳，張寧,，孫慧峰，董曉紅，徐紅丹,*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154007)

絕經后焦慮癥(Postmenopausal anxiety，PMA)的神經生物學機制尚不清楚，卵巢功能衰退并停止分泌雌激素是比較明確的直接因素，因而雌激素替代療法是臨床常用的治療方法，但是由于其致癌等副作用，應用受到限制[1]。精神藥物雖對本病治療效果尚佳，但因其具有成癮性等風險，患者服藥的依從性較差[2]。因此，尋找切實有效并且患者能接受的新藥十分有必要，而中藥具有明顯優勢。引火湯出自陳士鐸《辨證錄》， 原方組成：熟地三兩，巴戟天一兩，茯苓五錢，麥冬一兩，北無味二錢，具有“滋陰補腎、引火歸元”之功效[3]。更年期焦慮癥屬“陰虛火旺”型郁證范疇[4]，恰是引火湯適應之證候，并且本課題組前期研究顯示，引火湯對更年期綜合征中的諸多癥狀均有改善作用。本研究采用長期雙側卵巢摘除(Bilateral ovariectomies,OVX)的方法模擬絕經后狀態，觀察引火湯對長期OVX模型小鼠焦慮癥狀的治療作用，及其對體質量、子宮系數、子宮形態及海馬神經元存活數量等方面的影響，并探討這些指標的內在聯系，挖掘引火湯治療絕經后焦慮癥的藥效機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ICR品系小鼠，雌性，體質量20～25 g，由黑龍江中醫藥大學GLP實驗中心提供，合格證號：SCXK(黑)2013-0004。

1.2 實驗藥品及試劑

引火湯由熟地黃、巴戟天、茯苓、麥冬及北五味子組成，購于北京同仁堂哈爾濱分公司。補佳樂(戊酸雌二醇片)，生產批號：214A劑，購于拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司。

1.3 造模、分組及給藥

本研究采用長期雙側卵巢摘除術(OVX)聯合單頻超聲刺激(single-frequency ultrasonic stimulation，SFUS)復制絕經后焦慮癥模型。小鼠在10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉后采用背式術式行雙側卵巢摘除。假手術組(Sham組)暴露卵巢后，摘取同樣大小脂肪團代替卵巢。行為學實驗測試前給予各組小鼠SFUS 6 min，誘發焦慮狀態。

小鼠適應性飼養1周后，隨機分為假手術組(Sham組)、模型組(OVX組)、陽性藥組(E2組)和引火湯組(YHT組)，每組10只，分組后開始OVX手術，OVX術后第3天開始，連續5 d經陰道涂片觀察OVX手術是否成功，剔除不合格樣本。于OVX術后57 d開始連續灌胃給藥21 d。各組小鼠按0.1 mL/10 g給藥劑量灌胃，Sham組和OVX組小鼠生理鹽水灌胃， E2組小鼠給予戊酸雌二醇(0.013 mg/mL)，YHT組小鼠給予引火湯水煎劑(2.34 g/mL)。第78天進行行為學測試，行為學測試結束后各組小鼠取材。

1.4 引火湯煎劑的制備

熟地黃15 g，巴戟天10 g，麥冬10 g，茯苓5 g，北五味子5 g，共計45 g，加8倍量水浸泡2 h，水煎提取2次，各1 h，將2次所得藥液混合用旋轉蒸發儀濃縮至2.34 g/mL。

1.5 行為學實驗

1.5.1 明暗箱(Light and dark box,LDB)

LDB包括明箱、暗箱和明暗箱之間的穿梭洞三部分，明箱(60 cm×30 cm×20 cm)是白色開放箱體，暗箱(60 cm×30 cm×20 cm)是黑色封閉箱體，穿梭洞位于明暗箱中間(5 cm×5 cm)。將受試小鼠置于明箱內，立即開始計時，記錄分析5 min內小鼠在明箱停留時間和明暗箱穿梭次數。

1.5.2 高架十字迷宮(Elevetated plus maze,EPM)

將受試小鼠面向開放臂方向放置于中央平臺。測試結束后用95%酒精清潔EPM設備，實驗進行時保持環境安靜。記錄受試小鼠5 min內，開臂滯留時間百分比(OAT)和開臂進入次數百分比(OAE)兩個指標。

1.6 石蠟切片HE染色

各組小鼠取子宮后，稱重后固定于4%多聚甲醛中48 h，經脫水包埋過程制成蠟塊，各組取樣本切成石蠟片，37 ℃恒溫烘片48 h，開始HE染色。基本步驟：常規脫蠟，蘇木素染色，鹽酸酒精分化，淡氨水返藍，伊紅染色，脫水，透明，封片。

1.7 尼氏小體染色

本實驗以尼氏染色法觀察各組小鼠海馬神經元存活狀態。隨機在各組小鼠中選取5只，心臟灌流后取腦，取腦后固定方法和制片方法同“1.6”，烘片結束后開始染色，60 ℃1%甲苯胺藍溶液浸染30 min，自來水沖洗，脫水，透明，封片。

1.8 酶聯免疫分析(ELISA)法測定E2水平

各組小鼠行為學測試結束后，迅速斷頭，于冰上取腦，沿中縫矢狀切，將每只半腦稱重并記錄，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。勻漿時，取出標本，加9倍PBS充分研磨，離心機預冷4 ℃，13 000 r/min，離心20 min后小心吸取上清，分裝并保存于-80 ℃冰箱備用。采用酶聯免疫分析(ELISA)法測定腦組織內E2水平，本實驗ELISA試劑盒采用雙抗夾心法測定E2水平，按照說明書操作。

1.9 統計學處理及圖像分析

2 結果與分析

2.1 引火湯對長期OVX小鼠陰道細胞的影響

正常小鼠陰道細胞種類及特點隨著性周期的變化呈現出動情前期、動情期、動情后期和動情間期的周期性變化。陰道涂片結果顯示，OVX小鼠陰道細胞周期性變化消失，持續處于動情間期，特點為大量的白細胞伴有少量的上皮細胞，說明OVX手術成功。Sham組小鼠陰道細胞則出現典型的周期性變化，如圖1所示，A:完整的上皮細胞；B:大量角化細胞且密集成片分布；C:角化細胞和白細胞；D:白細胞伴有少數有核上皮細胞。

注：A:動情前期；B:動情期；C:動情后期；D:動情間期。圖1 各期小鼠陰道涂片(HE染色，×400)

2.2 引火湯對長期OVX小鼠在LDB、EPM實驗中各指標的影響

LDB、EMP實驗結果見表1，與Sham組相比，OVX組小鼠明箱停留時間、明暗箱穿梭次數均顯著減少(P<0.01)；與OVX組相比，YHT組小鼠明箱停留時間、明暗箱穿梭次數均顯著增加(P<0.01)。與Sham組相比，OVX組小鼠OAT、OAE均顯著降低(P<0.01，P<0.05)；與OVX組相比，YHT組小鼠OAT、OAE均顯著增加(P<0.01)。

2.3 引火湯對長期OVX小鼠腦內E2水平的影響

ELISA實驗結果見表2，根據標準品濃度與測得OD值繪制腦內E2標準曲線見圖2,經標準曲線函數換算各組小鼠腦內E2水平見圖3。與Sham組相比，OVX小鼠腦勻漿后測得腦內E2水平顯著降低(P<0.05)，與OVX組小鼠相比，YHT組小鼠腦內E2水平顯著升高(P<0.05)，但與E2組比較無統計學差異；說明引火湯可上調長期OVX小鼠腦內E2水平。

表2 各組小鼠OD值比較

2.4 引火湯對長期OVX小鼠體質量(BW)和子宮重量(UW)的影響

各組體質量及子宮重量見圖4，與Sham組相比，OVX組小鼠體質量(Body weight，BW)顯著增加(P<0.01)；與OVX組相比，YHT組小鼠體質量無顯著性差異。與Sham組相比，OVX組小鼠子宮重量(Uterus weight，UW)顯著減少(P<0.01)；與OVX組相比，YHT組小鼠子宮重量無顯著性差異。

圖2 腦內E2標準曲線

注：與Sham組比較，*P<0.05;與OVX組比較，#P<0.05。圖3 引火湯對長期OVX小鼠腦內E2水平的影響

注：與Sham組比較，**P<0.01；與OVX組比較，##P<0.01。圖4 引火湯對OVX小鼠BW、UW的影響

2.5 引火湯對長期OVX小鼠子宮形態的影響

各組子宮HE染色結果見圖5，Sham組小鼠子宮內膜連續完整，子宮壁細胞形態正常排列緊密有序，腺體豐富。與Sham組相比，OVX小鼠子宮內膜變薄且不完整，子宮壁萎縮，肌層細胞排列紊亂，可見胞膜破損核固縮，宮腔變窄。與OVX組相比，YHT組小鼠子宮形態未見明顯改變。

2.6 引火湯對長期OVX小鼠海馬神經元存活狀態的影響

尼氏染色結果見圖6，Sham組小鼠海馬齒狀回(DG)神經元排列規律緊密，尼氏體染色均勻豐富，藍色顆粒狀染色神經元數目多且排列有序。與Sham組相比，OVX小鼠海馬DG區神經元排列松散，大量神經元丟失，尼氏染色顆粒狀神經元數量明顯減少。與OVX組小鼠相比，YHT組小鼠海馬DG區顆粒神經元排列有序，尼氏體染色均勻豐富，尼氏染色陽性神經元數目多。

注：A:Sham組；B:OVX組；C:E2組；D:YHT組。圖5 各組小鼠子宮橫切面(HE染色，×400)

注：A:Sham組；B:OVX組；C:E2組；D:YHT組。圖6 各組小鼠海馬DG區(尼氏染色，×100)

3 討論

研究表明，焦慮癥發病是機體內環境平衡紊亂與外界負性刺激如長期應激共同作用的結果，目前認為，導致其發病的易感因素有下丘腦垂體腎上腺軸(HPA)亢進、性激素水平下降、神經營養因子缺乏等[5]。學者普遍認為焦慮癥發病關鍵部位在海馬，海馬是“海馬-穹窿-乳頭體-丘腦前核-扣帶回-海馬”構成的帕帕茲環(Papez 環路)中的關鍵部位，Papez環路是情感形式、本能相關的各種情緒等的神經解剖基礎[6]。雖然絕經后焦慮癥(PMA)的神經生物學機制尚不十分清楚，但流行病學及諸多實驗研究顯示絕經后雌激素斷崖式撤退是引起焦慮癥發作的最直接因素[7]，因為生理水平的雌激素可通過上調神經營養因子，改善神經元生長微環境等方式保護海馬神經元抵抗長期慢性應激性損傷[5]。因而臨床常用雌激素替代療法(Estrogen replacement therapy,ERT)治療絕經后抑郁癥。然而流行病學調查發現由于ERT方法可誘發多種生殖系統癌癥如乳腺癌、子宮內膜癌，基礎實驗研究發現補充外源性雌激素的致癌風險與其是否對雌激素受體有選擇性激活作用有關[8]。雌激素受體包括膜受體(GPR30)和核受體，核受體有兩種亞型，包括ERα和ERβ兩個亞型[9]。ERα主要在生殖功能相關器官表達,如乳腺、子宮和陰道等，是雌激素促進第二性征成熟的主要通路，同時也是ERT法誘發多種生殖系統癌癥的直接通路[10]。ERβ則主要表達在中樞，尤其是在海馬區高表達，是腦內雌激素發揮腦保護作用的優勢通路，ERβ通路參與認知、記憶及情緒調節功能[11-12]。因此，一般認為能上調體內雌激素水平或發揮類雌激素作用，并對ERβ通路有選擇性激活作用的藥物是治療PMA的理想藥物。

本課題組前期已經對“腎通于腦”理論的生物學實質進行了探討，證實補腎中藥可以上調體內雌激素水平或者通過類雌激素作用而發揮腦保護作用[13]，同時中藥復方具有多因素多靶點的特點，能夠針對疾病多個病理環節進行對因治療，相比于單一因素的治療有明顯的優勢。引火湯由“熟地黃、巴戟天、茯苓、麥冬、北五味”組成，具有“滋陰補腎、引火歸元”之功效，對陰虛火旺型更年期躁癥有改善作用。課題組前期已經證實引火湯可改善女性更年期綜合征小鼠的諸多癥狀，并且可上調血清雌二醇(E2)水平[14]。本實驗結果顯示，引火湯可以顯著改善PMA模型小鼠的焦慮癥狀，筆者同時發現引火湯與雌二醇對PMA模型小鼠的治療效果無顯著性差異。基于引火湯的藥效機理及前期研究結果，筆者推測引火湯有可能同樣以增強體內雌激素效應為基礎發揮抗PMA作用，然而對PMA而言，雌激素作用的靶器官在大腦。本實驗繼續檢測各組小鼠的腦內E2水平，實驗結果顯示，引火湯能上調長期OVX小鼠腦內E2水平，可見引火湯可通過補腎作用，上調血清及腦內E2水平。因此，在“益腎通腦”理論指導下，筆者推測引火湯治療PMA的機制之一是上調PMA模型小鼠腦內E2水平。本研究結果還顯示，雌二醇在改善海馬DG區神經元形態和功能的同時對長期OVX小鼠的體質量、子宮重量和子宮形態均有顯著改善作用，以ERα和ERβ在體內表達位置為基礎推測，外源性雌激素對以ERα和ERβ這兩種核受體并沒有選擇性激活作用，這是其引起致癌等副反應的主要機制。但是引火湯治療PMA同時，卻對長期OVX小鼠體質量和子宮重量無顯著性改變，對長期OVX小鼠的子宮形態無明顯改變，而子宮重量及形態的維持均與ERα通路激活有關，然而尼氏染色結果顯示，引火湯對中樞與E2有相似地保護作用，對海馬DG區神經元形態和功能有明顯改善作用。因此筆者推測，引火湯在上調長期OVX小鼠腦內E2水平的同時對ERα和ERβ這兩種核受體有選擇性激活作用。

4 結論

結合課題組前期研究，本實驗結果提示引火湯治療絕經后焦慮癥的機制可能是通過補腎作用上調血清及腦內雌激素水平，并對腦內雌激素核受體有選擇性，即對ERβ有選擇性激活作用而對ERα作用不明顯。因此，與雌激素替代療法相比，引火湯在治療絕經后焦慮癥的同時可能會降低致癌等風險，筆者將繼續對引火湯治療PMA的神經生物學機制進行深入研究，為研發安全有效的抗絕經后焦慮癥的新藥提供新思路。