自擬醒神湯對血管性癡呆大鼠行為學及炎性細胞因子的影響

朱明瑾，羅斌，王戈，毛萌

(1.北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 100029；2.北京中醫藥大學，北京 102488)

血管性癡呆(Vascular dementia，VD)是指腦血管疾病引起腦損害導致的癡呆，是腦卒中的常見并發癥，是繼阿爾茨海默病之后第二常見的癡呆，其主要特征為認知功能的受損及相關的神經功能障礙。隨著腦卒中發病的逐年增加，VD的發病率近年也呈升高趨勢，其確切的發病機制，至今仍未明確。本實驗采用自體血栓法建立血管性癡呆模型，觀察VD大鼠行為學變化及海馬區炎性細胞因子腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)的含量變化,旨在探討炎性反應在VD發病中的作用。并采用益腎調氣中藥進行干預治療,觀察益腎調氣中藥對VD大鼠行為學及海馬區炎性細胞因子TNF-α、IL-1β的影響,為VD的臨床治療尋找新的臨床思路及藥物。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康Wistar雄性大鼠，清潔級，體質量(250±50)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2013-0006。飼養于SPF級實驗動物中心，自由喂食和飲水(應激時禁食、禁水除外)，室溫20 ℃～22 ℃(冷、熱應激除外)，相對濕度60%～70%，光照周期12 h。

1.2 主要藥品與儀器

自擬醒神湯(由熟地黃、郁金、益智仁、當歸、川芎等組成)，由北京中醫藥大學中藥教研室鑒定；尼莫地平片(國藥準字 H20003010)。Morris水迷宮程序自動控制儀由北京中醫藥大學實驗室提供。

2 實驗方法

2.1 模型制備

大鼠常規喂養3 d后，進行Morris水迷宮實驗預篩選，計算所有大鼠的平均潛伏期，剔除過慢及過快的，根據潛伏期將剩余大鼠分為3個層次：0～20 s、20～40 s和40～60 s，從每層隨機選出10只老鼠，共計30只作為正常組，其余為造模組。

VD模型制備：首先制備自體血栓：大鼠頸總動脈采血，之后將處理后的干燥血凝塊研細，并通過200 μm篩孔制成栓子，造模時用鹽水配成30 g/L的懸浮液。用10%水合氯醛(400 mg/kg)成功麻醉動物，常規消毒后切開頸部正中，分離組織和筋膜，暴露左頸總、頸內、頸外動脈。暫時夾閉頸總動脈和頸外動脈近心端，并通過頸總動脈的遠心端將懸浮液推入頸內動脈以黏附血管傷口。立即打開頸總動脈以恢復血流供應，使栓子通過頸內動脈進入大腦前動脈、大腦中動脈及其側支，打開頸外動脈，恢復血供和縫合。24 h后觀察造模是否成功。上述動物養至4周后，通過Morris水迷宮實驗篩選出記憶障礙的癡呆大鼠。有顯著學習記憶障礙的大鼠為VD大鼠模型(以第一次水迷宮檢測的大鼠平均逃避潛伏期作為參考值，計算造模后大鼠平均逃避潛伏期和參考值之差與參考值的比值，超過20%為癡呆大鼠)。

2.2 動物分組及給藥

將水迷宮篩選出的造模大鼠隨機分為模型組、中藥組、西藥組，每組各10只。正常組常規飼養，模型組灌胃雙蒸水，中藥組灌胃自擬醒神湯(濃度0.62 g/mL，4 ℃冰箱保存，臨用前加熱)，西藥組灌胃尼莫地平[9.45 mg/(kg·d)，灌胃前溶于雙蒸水中]。每周根據體質量變化調整灌胃量。每組大鼠每天按劑量胃內給藥1次，共30 d。30 d后采用Morris水迷宮實驗檢測學習記憶能力。

2.3 大鼠行為學測試

Morris水迷宮法檢測大鼠的空間學習記憶能力。包括定位航行實驗和空間探索實驗。

2.3.1 定位航行實驗

反映大鼠的學習能力。參照趙清山[1]方法測試，大鼠平臺逃避潛伏期為大鼠從入水到找到平臺后爬上平臺所需的時間，以此作為大鼠空間學習能力的檢測指標。

2.3.2 空間探索實驗

反映大鼠的記憶能力。參照趙清山[1]方法測試，第6天撤走平臺后依次將大鼠從各象限放入水中，分別記錄其跨越原來平臺的次數作為空間記憶的檢測指標。大鼠完成定位航行實驗后，于第6天進行空間探索實驗。

2.4 炎性細胞因子測定

ELISA法測定各組腦區TNF-α、IL-1β的含量變化。

檢測方法：將動物斷頭后，將全腦剝離，并在冰盤上快速分離雙側海馬，稱重后(約需要200 mg)將其置于EP管中并用液氮快速冷凍，轉移至-80 ℃冰箱中儲存。操作程序按說明書進行。

2.5 統計學處理

全部實驗數據以M±SE表示，單因素方差分析用于組間樣本均數比較(One-way ANOVA)，結合Post Hoc Multiple Comparison的LSD與SNK檢驗，以P≤0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 行為學

3.1.1 各組大鼠平臺逃避潛伏期

正常組、西藥組和中藥組與模型組比較，正常組、西藥組和中藥組大鼠隱蔽平臺試驗逃避潛伏期縮短(P<0.05)。見表1。

3.1.2 各組大鼠探索實驗結果

正常組、西藥組和中藥組與模型組比較，正常組、西藥組和中藥組大鼠停留原平臺象限時間延長(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠平臺逃避潛伏期的比較

表2 各組大鼠探索實驗結果及當天的速度比較

3.2 炎性細胞因子

TNF-α：模型組較正常組明顯升高，有顯著差異(P<0.01)；正常組、中藥組、西藥組與模型組比較有顯著差異(P<0.01)；中藥組、西藥組兩組間無差異。IL-1β：模型組較正常組明顯升高，有顯著差異(P<0.01)；正常組、中藥組、西藥組與模型組比較有顯著差異(P<0.01)；中藥組、西藥組兩組間無差異。見表3。

表3 各組大鼠炎性細胞因子比較

4 討論

血管性癡呆屬于“呆病”“健忘”“癡呆”等范疇。筆者根據多年經驗，認為腎虛肝郁在血管性癡呆的發病過程中起重要作用。課題組通過大量的臨床實踐研究，自擬醒神湯(熟地黃、郁金、益智仁、當歸、川芎等)，該方由地黃飲子加減而成，方中熟地黃為君藥，具有益腎補精、滋陰養血等功效;郁金為臣藥，能行氣解郁、活血祛瘀、安神開竅;君臣合用有益腎調氣、祛瘀醒神之功效;諸藥合用，相輔相成。全方共奏補腎益氣、活血祛瘀、醒神開竅之效。本課題組前期的實驗研究亦證實：采用益腎調氣法治療血管性癡呆，可有效改善患者認知、記憶、語言及視空間等方面的總積分，提高社會及日常生活能力?，F代藥理研究證實其藥物組成可直達病所，對疾病治療起到事半功倍的效果。研究發現[2]，熟地黃中的環烯醚萜類化合物——梓醇，能減少LDH的釋放，降低NO等炎癥因子的含量，而達到保護神經元的作用。郁金可以通過降低 MDA 的含量并提高腦組織中的 SOD 活性而對抗自由基的損傷[3]。

目前對于血管性癡呆的發病機制仍未十分明了。有研究報道，炎性反應在血管性癡呆的發生與發展中發揮著重要作用[4-5]。炎性反應是指活體組織對損傷因子的防御反應，其基本的病理變化包括局部組織的變性、滲出和增生。炎癥反應還參與腦白質損傷的發生，并且在腦梗塞及隨后的繼發性神經損傷中起重要作用。有研究表明，腦缺血時大量白細胞在多因素綜合作用下聚集在梗死區域及其周圍。炎性反應在白細胞聚集的過程中發揮著重要的作用[6]。炎性細胞因子是腦缺血損傷過程產生的重要的免疫因子。根據在炎性反應中的作用分為促炎因子和抗炎因子兩大類[7]。研究報道，炎性細胞因子在炎性反應中相互作用是復雜的，并且具有一定的協同作用。如炎性因子TNF-α、IL-1β均可誘導IL-8的表達，形成級聯反應，并通過激活單核-吞噬細胞等，增強其殺傷及吞噬功能，從而加劇局部的炎癥反應，進一步加重缺血性腦損傷[8]。

本實驗采用Morris水迷宮實驗和ELISA方法分別對血管性癡呆大鼠行為學及海馬中TNF-α、IL-1β的表達水平進行評價，結果顯示：Morris水迷宮實驗中，與模型組比較，自擬醒神湯組能縮短平臺試驗逃避潛伏期，延長停留原平臺象限時間。提示該方能夠改善VD大鼠的學習及記憶能力。ELISA方法測定炎性細胞因子中，與模型組比較，自擬醒神湯組能夠明顯降低海馬區TNF-α、IL-1β的表達水平，提示自擬醒神湯能夠有效抑制炎性反應，從而減輕血管性癡呆大鼠腦組織的損傷。然而其通過何種信號傳導通路對炎性細胞因子起抑制作用，其深入的機制仍待進一步研究。