腸康方聯用結腸靶向益生菌對IBS-D大鼠的協同治療作用研究

謝慧，陸敏，樊欣鈺

(1.南京中醫藥大學第三臨床醫學院，江蘇 南京 210023； 2.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院，江蘇 南京 210028；3.南京市溧水區中醫院，江蘇 南京 211200；4.江蘇衛生健康職業學院臨床學院，江蘇 南京 211200)

腹瀉型腸易激綜合征(Diarrhea predominant irritable bowel syndrome,IBS-D)是一種臨床上常見的胃腸功能紊亂性疾病，對患者的生活質量往往有明顯的負面影響。有流行病學調查研究顯示其患病率為10%～20%[1]，且呈逐年上升的趨勢。目前臨床尚缺乏有效的治療藥物。近些年來，中醫藥在治療IBS-D方面取得了良好的效果，且未見明顯的毒副作用；益生菌被國際益生菌和益生元科學協會(ISAPP)推薦在IBS中使用，也具有“安全無毒”的特點。因此，臨床上采用中藥聯用益生菌的方法治療IBS-D日益增多，但其機制尚不明確。本研究將采用名老中醫驗方“腸康方”聯合結腸靶向益生菌干預IBS-D大鼠，通過動物實驗來探討其協同作用的機理，為臨床診治提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物及分組

成年健康清潔級Wistar大鼠(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(上海)2013-0016)。50只，體質量(169.8±20)g，雌雄各半，SPF級實驗動物中心飼養，環境溫度(23±3)℃，濕度(55±5)%，自然光照條件。將造模成功后的大鼠進行分組，共5組，分別為腸康方組、結腸靶向益生菌組、腸康方聯用結腸靶向益生菌組、模型對照組及空白對照組。每組大鼠10只。

1.2 實驗藥物

1.2.1 腸康方

采用名老中醫驗方“腸康方”，已獲得國家發明專利(ZL201110336380.2)[2]。由白芍、防風、熟地黃、菟絲子、黃連、金蕎麥及蟬蛻7味中藥組成，組方藥材根據 2010 版《中國藥典》的相關規定項進行檢測，所有入藥的飲片均符合要求。分別加10倍、8倍量的水煎煮，每次1.5 h，合并煎煮液，濃縮至生藥量為0.5 g/mL，置4 ℃保存。用藥參照成人劑量，按照“動物體表面積比率換算等效劑量法”計算大鼠給藥量。

1.2.2 結腸靶向益生菌

結腸靶向益生菌膠囊為一種結腸定位釋放膠囊，擁有國家發明專利(CN00117989.6)[3]。膠囊內益生菌為同一批次培菲康(雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌)，國藥準字S10950032；廠家：上海信誼；藥品電子監管碼：81537950432214176108。并按照“動物體表面積比率換算等效劑量法”計算大鼠給藥量，每次灌服1個膠囊。

2 方法

2.1 IBS-D大鼠模型的建立

模型采用番瀉葉灌胃疊加束縛刺激法。Wistar大鼠適應性喂養，實驗前10 h禁食不禁水，給予濃度為0.3 g/mL番瀉葉煎劑灌胃，灌胃體積為每千克體質量10 mL，每天1次，灌服番瀉葉水1 h后立即用粗制的棉繩束縛大鼠的兩肢，使其活動不利，焦躁不安，形成一定的刺激，持續2 h，持續2周。空白對照組正常飼養，不采取任何措施。

2.2 給藥和取材

腸康方組、結腸靶向益生菌組、腸康方聯用結腸靶向益生菌組和模型對照組，分別給予腸康方灌胃、結腸靶向益生菌灌胃、腸康方聯用結腸靶向益生菌灌胃和等容積的蒸餾水灌胃；空白對照組給予等容積的蒸餾水灌胃。所有大鼠灌胃容積均為每千克體質量10 mL，連續灌胃給藥2周。每日觀察一般情況，于末次給藥后次日空腹采血，測定各項指標，采血后處死并取全部結腸組織。

2.3 研究指標

2.3.1 一般情況

觀察大鼠的精神、活動、鼠毛、目光、食欲等情況，計算其腹瀉改善率。

2.3.2 大鼠腸道菌群的檢測

取新鮮無污染的大鼠糞便0.5 g，采用高通量測序的方法檢測腸道菌群物種的豐度、多樣性及構成的變化趨勢，采用DNA抽提試劑盒對樣本的基因組DNA進行提取，細菌多樣性鑒定對應區域：16S V3-V4區。

2.3.3 大鼠腸組織ZO-1的表達

將大鼠處死后，取近直腸端處約1 cm結腸，固定在甲醛中，用石蠟將其包埋，進行切片后再行免疫組化染色。免疫組化染色后，在顯微鏡下觀察，每個標本隨機選取5個視野，若出現棕黃色染色的顆粒為陽性反應，反之無棕黃染色則為陰性，每個視野利用拍攝器截取圖像保存。應用Image Pro Plus 軟件測定其陽性表達的光密度(optical density, OD)值進行半定量分析，取其平均值,以測定結腸ZO-1的表達。棕黃色染色越多，OD值就越大，水平越高。

2.4 統計學處理

所有數據錄入SPSS 13.0統計軟件包，以均數±標準差表示，采用q檢驗及LSD檢驗，P≤0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠的腹瀉情況

空白對照組大鼠大便正常，造模組大鼠造模前2 h排便粒數與空白對照組比較沒有統計學意義(P>0.05)；造模開始后，造模組大鼠造模后大便變軟，或成稀狀、稀水狀，隨著時間推移情況無明顯好轉，2 h的排便粒數與空白對照組相比較明顯增多(P<0.01)。見表1。

表1 造模前后大鼠2 h排便粒數

藥物干預后，空白組大鼠在藥物干預期間大便正常，各藥物干預組大鼠腹瀉癥狀逐漸消失，大便逐漸恢復正常，而模型對照組與空白對照組相比，2 h排便粒數明顯增多；給藥干預組與模型對照組比較，2 h排便粒數均有不同程度的減少(P<0.05)，尤其以腸康方聯用結腸靶向益生菌組的減少最為明顯(P<0.01)。見表2。

表2 藥物干預后各組大鼠2 h排便粒數

3.2 大鼠的腸道菌群變化

與空白對照組小鼠相比，IBS-D小鼠的α多樣性指標shannon指數明顯偏低，腸康方組、結腸靶向益生菌組及腸康方聯用結腸靶向益生菌組，shannon指數較模型組增加,見圖1。β多樣性分析結果見圖2，模型對照組與空白對照組大鼠腸道菌群OUT水平上的差異在PCoA及NMDS圖上能夠較好的區分，而給腸康方、結腸靶向益生菌及腸康方聯用結腸靶向益生菌的IBS-D大鼠腸道菌群趨向于正常組。其中腸康方聯用結腸靶向益生菌組IBS-D大鼠腸道菌群更趨向于正常組，說明腸康方聯用結腸靶向益生菌組可更好維持腸道菌群的多樣性。

圖1 α多樣性分析

3.3 大鼠對照結腸組織ZO-1的表達

空白對照組大鼠腸組織中的ZO-1蛋白表達明顯。模型對照組與空白對照組相比，結腸黏膜組織中ZO-1蛋白表達顯著降低。腸康方組與模型對照組相比，大鼠腸組織ZO-1蛋白的表達增加不明顯，無統計學意義。結腸靶向益生菌組大鼠腸組織ZO-1蛋白表達稍有增加，但增加程度有限(P<0.05);腸康方聯用結腸靶向益生菌組大鼠腸組織ZO-1蛋白表達增加較為顯著(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠腸組織ZO-1光密度值比較

圖2 β多樣性分析

4 討論

IBS-D是腸易激綜合征最常見的一個亞型，其病理機制尚不明確，目前認為其與腸道菌群失調、腸道黏膜屏障和免疫功能異常、腦腸軸失調等因素有關[4]。IBS-D的發生與腸道菌群失調關系密切[5]。腸道菌群具有保護腸道黏膜的完整性、防止病原體的入侵、調節胃腸道功能及免疫系統等作用[6-7]。腸道菌群之間與機體之間相互依賴生存、相互克制約束，保持動態平衡，一旦這種平衡被打破，則會引起免疫代謝紊亂，進而發生各種腸道疾病[3]。有研究表明，腸道菌群紊亂普遍存在于IBS-D患者中，表現為腸桿菌數量增多，乳桿菌、類桿菌及雙歧桿菌數量降低，菌群的密集度及多樣性顯著降低等[8]。郭文濤等[9]研究顯示，IBS-D患者的腸道菌群和健康人的腸道菌群相比多樣性下降(P<0.05)，提示IBS-D的發病與菌群失調有關。Gareau等[10]用母嬰分離法構建的IBS-D大鼠模型，研究顯示模型組大鼠的腸道乳桿菌數減少。劉佳星等[11]通過高通量測序的方法研究發現“四神丸”可通過增加腸道內益生菌豐度，減少有害菌豐度，來調節腸道微生態系統的平衡，從而起到治療IBS-D的作用。

本次研究顯示腸康方、結腸靶向益生菌及腸康方聯用結腸靶向益生菌均能改善IBS-D模型大鼠的腹瀉癥狀(P<0.05)，尤其是以腸康方聯用結腸靶向益生菌組改善最為明顯(P<0.01)。通過對各組大鼠糞便進行高通量測序后發現給予腸康方、結腸靶向益生菌及腸康方聯用結腸靶向益生菌的IBS-D大鼠腸道菌群均趨向于正常對照組，且腸康方聯用結腸靶向益生菌組IBS-D大鼠的腸道菌群更趨向于正常對照組大鼠，說明腸康方聯用結腸靶向益生菌組可更好的維持IBS-D大鼠腸道菌群的多樣性。

腸黏膜屏障是人體最為重要的屏障之一，它是一道維持腸腔和機體內環境穩定的動能隔離帶，腸黏膜屏障可以使腸腔內容物選擇性的通過，能夠有效的阻止病原體及其毒素侵入人體內[12]。腸黏膜屏障功能與腸黏膜上皮細胞間的緊密連接(tight junction，TJ)息息相關[13]，TJ是一種能夠維持腸上皮黏膜屏障完整性的重要結構[14]，而ZO蛋白對于TJ的構成和屏障功能的維持具有重要的作用[15]。ZO-1可將跨膜蛋白和肌動蛋白系統連接在一起，構成穩定的細胞連接系統，常作為一種檢測緊密連接的標志性蛋白。有研究顯示[16],各亞型IBS大鼠存在腸黏膜機械屏障功能不足，表現為ZO-1減少。Martínez等[17]實驗顯示,IBS-D患者的腸黏膜中ZO-1 mRNA表達明顯低于正常人，ZO-1從TJ解離至細胞質內，因此可致TJ結構功能失調，黏膜通透性改變，從而導致IBS-D的發生。

本實驗通過對各組大鼠腸組織免疫組化染色分析后發現IBS-D模型大鼠經結腸靶向益生菌及腸康方聯用結腸靶向益生菌干預后腸組織ZO-1表達顯著增加，而以后者增加更為顯著，可見腸康方聯用結腸靶向益生菌能更好的通過增強黏膜屏障功能來達到治療IBS-D大鼠的作用。

腸康方為全國名老中醫驗方，由明朝《景岳全書》中“痛瀉藥方”及“心腎丸”化裁而來。方中君以白芍養血柔肝、緩急止痛，防風散肝舒脾、勝濕止瀉，既疏肝也能達到健脾的效用，全方共奏調和肝脾、緩痛止瀉等功效。前期動物實驗也顯示腸康方與陽性藥匹維溴銨均能通過減少腸組織5-羥色胺的表達，促進5-羥色胺轉運體的表達來達到改善IBS-D大鼠的癥狀(P<0.05)。李雪等[18]證實腸康方可使大鼠血漿P物質減少，同時可使IBS-D大鼠結腸組織血管活性腸肽增多，以達到治療IBS-D的效果，且療效甚于陽性藥馬來酸曲美布汀。由此說明，腸康方對IBS-D有確切的療效。

綜上所述，腸康方聯用結腸靶向益生菌對IBS-D大鼠具有協同治療作用，可更好的改善模型大鼠的腹瀉癥狀，其機制可能與調節腸道菌群及增強腸黏膜屏障功能有關，但其多靶點的協同作用機制還有待進一步深入探索。