通絡生骨膠囊對軟骨氧化損傷的保護作用及其機制探討

林惠湦，李譯，陳妮，魏軍漁

(1.浙江海正藥業股份有限公司，浙江 臺州 318000；2.寧波市第六醫院，浙江 寧波 315040)

骨關節炎(OA)又被稱為退行性骨關節炎，是易高發于中老年群體中的一種退行性病變,主要以關節軟骨的退化損傷，關節腔中炎癥因子高表達，關節邊緣部位和軟骨下骨反應性增生作為主要的病理特征，具有一定程度的致殘性[1]。關節軟骨的損傷是OA的標志性特征，OA具體的發病機制研究目前尚不明確，但軟骨細胞的活率、炎癥的嚴重程度、氧化損傷和軟骨的纖維化程度均與疾病的發展進程密切相關。通過促進軟骨細胞的增殖，抑制過度氧化應激對軟骨細胞的損傷，降低炎癥因子的表達及其對下游信號通路的作用均是骨關節炎治療藥物的研發熱點[2]。通絡生骨膠囊是目前唯一用于治療股骨頭壞死的中藥單方，研究發現其具有活血健骨、化瘀止痛的作用[3]。其主要成分是木豆葉提取物，有研究發現木豆葉水提物可以通過激活抗氧化應激信號通路改善心肌缺血再灌注損傷[4-5]，提示通絡生骨膠囊或可通過抑制氧化應激對軟骨細胞的損傷作用，發揮治療OA的作用。本實驗利用通絡生骨膠囊對正常以及H2O2損傷的軟骨細胞進行干預，并觀察干預后其對軟骨細胞的增殖、抗氧化應激和Wnt/β-catenin信號通路的影響，從而探討通絡生骨膠囊治療骨關節炎的研究前景以及作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與材料

通絡生骨膠囊：通絡生骨原料藥由海正藥業股份有限公司生產，批號為J31709061;SW13531細胞(ATCC)。RPMI 1640培養基、胎牛血清、0.25% Trypsin-EDTA(Gibco);TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金);SuperReal PreMix Color (SYBR Green,天根生物);SKL-2001(MCE);細胞活性檢測試劑盒(Promega);雙氧水(國藥集團);Trizol(Invitrogen);Nrf2(Abcam公司);HO-1、β-catenin、Keap-1(CST);Tubulin(Sigma)。

引物由上海杰瑞生物科技有限公司合成，Nrf2 上游引物：TCCA GTCA GAAA CCAG TGGA T 下游引物：GAAT GTCT GCGC CAAA AGCT G。Wnt4α上游引物：GCTC TGAC AACA TCGC CTAC 下游引物：TCGC CAGC ACGT CTTT AC。β-catenin上游引物：AGCT CCCT C GCGG TTCA T 下游引物：GGGC GGCA CCTT CCTA CTTC。GAPDH上游引物：ATGG CCTT CCGT GTTC CTAC C 下游引物：GCCC AAGA TGCC CTTC AGTG。

1.2 通絡生骨膠囊對SW1353細胞活性的影響

參考文獻[6],取增殖良好的SW1353細胞軟骨細胞以1 500個/孔分別接種至96孔板，置于37 ℃、5% CO2、100%相對濕度細胞培養箱中預培養24 h。Blank孔(純培養基)及Control孔(純細胞孔)加入10% FBS RPMI 1640培養基，給藥孔分別加入濃度為1、5、10、50和100 μg/mL的通絡生骨膠囊溶液(10% FBS RPMI 1640培養基配制，微孔濾膜過濾除菌后使用)。每個濃度設置6個復孔，振蕩混勻后，繼續培養72 h。結束培養后每孔加入發光細胞活力檢測試劑100 μL，放置于恒溫振蕩器中室溫振蕩15 min，檢測細胞活率。實驗重復3次，取平均值。

細胞增殖率(%)=(觀察組OD值-空白組OD值)/(Control組OD值-空白組OD值)×100%

1.3 通絡生骨膠囊對SW1353的氧化保護作用

取增殖良好的SW1353細胞以1 500個/孔分別接種至96孔板，置于37 ℃、5% CO2、100%相對濕度細胞培養箱中預培養24 h。Blank、Control及Model孔加入10% FBS RPMI 1640培養基，給藥組加入含1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的通絡生骨膠囊溶液。每個濃度設置6個復孔，振蕩混勻后，繼續培養72 h。72 h后，除Blank和Control孔加入1 μL 1640培養基，Model及給藥孔加入含H2O2的1640培養基1 μL(終濃度為300 μmol/L)，振蕩混勻后，37 ℃培養60 min。每孔加入發光細胞活力檢測試劑100 μL，放置于恒溫振蕩器中室溫振蕩15 min，檢測細胞活率。實驗重復3次，取平均值。

細胞增殖率(%)=(給藥組OD值-空白組OD值)/(Control組OD值-空白組OD值)×100%

1.4 通絡生骨膠囊對Nrf2/ARE及Wnt/β-catenin信號通路中 mRNA表達的影響

取增殖良好的SW1353細胞以2×105個/孔接種至6孔板，置于37 ℃、5% CO2、100%相對濕度細胞培養箱中預培養24 h。Blank、Control及Model孔加入10% FBS RPMI 1640培養基，給藥孔加入含1、5、10、50和100 μg/mL的通絡生骨膠囊溶液，振蕩混勻后繼續培養72 h。72 h后，Model及給藥孔加入10μL含H2O2溶液使其終濃度為300 μmol/L，振蕩混勻。37 ℃培養60 min后，棄去培養基，收集細胞加Trizol裂解后提取總RNA，用于檢測細胞Nrf2，HO-1，Wnt4α及β-catenin的 mRNA表達水平(實驗重復3次)。熒光定量PCR檢測按照熒光定量試劑盒說明書操作，Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀檢測，結果以相對表達定量(relative quantity，RQ)表示。

RQ=2-ΔΔCt

其中，ΔΔCt=待測標本的ΔCt-Control標本ΔCt；ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct值。

1.5 通絡生骨膠囊對Nrf2/ARE及Wnt/β-catenin信號通路中蛋白表達的影響

取增殖良好的SW1353細胞以2×105個/孔接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2、100%相對濕度細胞培養箱中預培養24 h。Blank、Control及Model孔加入10% FBS RPMI 1640培養基，給藥孔加入含1、5、10、50 和100 μg/mL的通絡生骨膠囊溶液，振蕩混勻后繼續培養72 h。72 h后，Model及給藥孔加入10 μL含H2O2溶液使其終濃度為300 μmol/L，振蕩混勻，37 ℃培養60 min后，棄去培養基，收集細胞提取細胞總蛋白，經SDS-PAGE 電泳后，低溫轉印至PVDF膜，牛奶封閉1 h，再與相應的一抗、二抗雜交各1 h，用凝膠成像系統對圖像進行拍照和分析Nrf2、HO-1、Keap-1和β-catenin的蛋白表達水平(實驗重復3次)。

1.6 統計學處理

結果采用SPSS17.0統計軟件進行數據處理，實驗數據進行Dunnett’s test檢驗。P≤0.05表示具有統計學意義。

2 結果

2.1 通絡生骨膠囊對SW1353細胞存活率的影響

通絡生骨膠囊作用72 h可有效促進SW1353細胞的增殖，與Control組相比，5、10、50 和100 μg/mL通絡生骨膠囊組細胞存活率明顯上升，且具有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。預實驗表明采用濃度為300 μmol/L H2O2可對細胞產生明顯的損傷作用，與Control組相比，細胞活率僅為20%，因此后續采用該濃度為H2O2的損傷濃度；給予5、10、50、100 μg/mL通絡生骨膠囊預處理的細胞活率顯著性提高(P<0.01)，提示通絡生骨膠囊可降低H2O2對軟骨細胞的損傷,結果見圖1。

圖1 通絡生骨膠囊對軟骨細胞活率的影響(%)

2.2 通絡生骨膠囊對Nrf2/ARE及Wnt/β-catenin信號通路中 mRNA表達的影響

在SW1353細胞中，與Control組相比，經H2O2處理后細胞Nrf2和HO-1的mRNA表達受抑制，Wnt4α和β-catenin的mRNA表達上升；經10、50和100 μg/mL通絡生骨膠囊預處理的軟骨細胞Nrf2和HO-1的mRNA表達上升，Wnt4α和β-catenin的mRNA表達水平下降，差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)，結果見圖2。

圖2 Nrf2/ARE及Wnt /β-catenin信號通路中 mRNA表達水平

2.3 通絡生骨膠囊對Nrf2/ARE及Wnt/β-catenin信號通路中蛋白表達的影響

在SW1353細胞中，與Control組相比，經H2O2處理后，細胞內Nrf2水平略微下降，β-catenin、 HO-1及Keap-1蛋白水平上升；與Model組相比，經50 μg/mL和100 μg/mL通絡生骨膠囊預處理可有效增強Nrf2及HO-1的蛋白表達，抑制Keap-1及β-catenin的蛋白表達，結果見圖3。

圖3 Nrf2/ARE及Wnt/β-catenin信號通路中蛋白表達水平

3 討論

骨性關節炎(OA)是由于一系列內外界因素導致了關節的重組異常，使得軟骨細胞與基質均發生改變，進而關節軟骨軟化甚至喪失，軟骨下骨硬化形成骨贅[7]。軟骨細胞是骨關節腔中軟骨組成的重要細胞，其在OA的進程中起到至關重要的作用。由于缺少神經和血管等的分布，軟骨細胞的修復能力很低，當外界的損傷超出軟骨細胞的修復范圍時，就會造成退行性的病變。因此維持軟骨細胞的活性、增強其對外界損傷的抵抗作用，對治療和延緩骨關節炎的進程具有重要意義[8]。

氧化應激是機體自身防御的一個重要體系，當自由基、活性氧(ROS)過度產生，無法被及時清除時，會使得機體內的氧化/還原失衡，從而損傷機體本身產生病變。氧化應激在OA的發生發展進程中起到十分重要的作用，李盛華等[9]發現，骨關節炎患者的骨關節腔中ROS、NO等氧自由基出現明顯升高，提示氧自由基參與了骨關節炎病理進展的過程。氧化應激還會導致端粒酶縮短，膠原氧化裂解、使得軟骨損傷加劇增強骨關節炎的發生率；ROS等還可以間接或者直接的作用在蛋白質上，改變其構象導致軟骨細胞合成代謝障礙，加速其凋亡[10]。

Nrf2/ARE信號通路是機體調節內源性抗氧化系統的關鍵信號通路[11]。通過激活Nrf2/ARE抗氧化信號通路，誘導HO-1、GCLC等一系列細胞保護基因和解毒基因的表達，顯著增強細胞抗氧化應激損傷的能力[12-13]。Wnt/β-catenin信號通路的激活與OA的形成和發展過程中起到極重要的作用[14]。Won Dong Kim等[15]研究發現β-catenin的下調可以有效激活Nrf2，加強其核定位，可進一步加強Nrf2/ARE信號通路的活化發揮抗氧化作用。

在本次研究中發現：通絡生骨膠囊可顯著性促進軟骨細胞增殖(SW1353細胞)，具有明顯的劑量效應。通過H2O2損傷Model發現，不同濃度的通絡生骨膠囊(10、50和100 μg/mL)可提高軟骨細胞的存活率，降低H2O2對軟骨細胞的損傷作用。進一步的觀察發現通絡生骨膠囊能誘導軟骨細胞內Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表達，抑制Keap-1的蛋白表達，活化Nrf2/ARE信號通路發揮抗氧化損傷作用。同時，研究發現通絡生骨膠囊(50和100 μg/mL)能有效抑制軟骨細胞中H2O2誘導的Wnt4α及β-catenin的mRNA和蛋白表達水平上調，從而進一步激活Nrf2/ARE信號通路，達到抗氧化損傷的作用。

綜上所述，通絡生骨膠囊可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化，激活Nrf2/ARE信號通路，促進軟骨細胞增殖，降低自由基等對軟骨細胞的損傷作用，提高軟骨細胞的活率，從而延緩骨關節炎的進程，提示通絡生骨膠囊具有預防和治療骨關節炎的研究前景。