重金屬鉛、鎘及其互作脅迫下油菜種子萌發差異分析及篩選

肖 雪，張秀俠，陳玉琳，章潔瓊，張 超，常莉麗

(1.貴州師范大學，貴陽 550025；2.貴州省農作物技術推廣總站，貴陽 550001)

貴州省礦產資源豐富，土壤中蘊含著較高濃度的Pb、Cd、Hg、As等離子，全省土壤環境污染嚴重。其中Pb為灰白色質軟金屬，對人體神經系統、血液血管都有毒害作用；Cd為人體非必須元素，對人體有極大危害。研究發現，曾在日本發生的“痛痛病”與患者體內的Cd含量有關。重金屬離子不僅對人體有嚴重損害，也不利于植物的生長發育，當其濃度超過一定值時，對植物生長有著極大的影響[1]。植物體內的重金屬含量超過一定閾值后，將會抑制植物細胞的光合作用和酶活性、并促進細胞內的ATP分解，改變細胞膜的通透性，甚至可干擾植物體內已存在的細胞間及整株水平上的水分及離子穩態平衡，甚至造成植物DNA損傷，最終導致植物生長量、產量及品質的下降[2-5]。高濃度的Cu2+、Na2CO3處理油菜種子，其萌發及根的生長均受到不同程度的抑制[6-7]。Gurpreet等[8]用250 μmol/L的Pb2+溶液處理小麥根尖細胞時發現，小麥根尖細胞核內的核仁變小，并且細胞內出現了腫塊狀的結構，當Pb的量上升為500 μmol/L后細胞核解體。Hu等[9]用Pb2+溶液處理菹草，發現其葉片細胞核中的核仁分散，染色質凝集，核膜遭到了嚴重的破壞。

油菜(BrassicanapusL.)是世界上三大油料作物之一，原產于中國，屬十字花科蕓薹屬一年生草本長日照作物，作為重要的種植蔬菜和食用植物油供給作物，其產量和種植面積都居世界首位，在農業經濟上也發揮著重要作用[10-12]。油菜生長發育過程中，水分需求量為60%～85%；自身具有強抗寒力，但是抗旱性較差；對土壤要求不及其他作物嚴格，沙土、粘土、紅黃土壤均能正常生長[13]。劉銀鳳研究表明，干旱脅迫對油菜種子萌發及生長的抑制作用極其明顯，直接導致種子不萌發或植株矮小[14]。油菜種子的萌發受諸多因素的影響，為適應目前土壤環境而正常生長發育，篩選能夠抗逆境生長的油菜品系尤為重要。

本研究以124份油菜種質為材料，在重金屬脅迫下，篩選對鉛、鎘具有耐性的油菜種質，旨在為油菜育種提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來源于貴州師范大學生命科學學院，共計124份油菜種質。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設計

試驗采用無水氯化鉛和氯化鎘配置鉛、鎘離子溶液，濃度設置為Pb：90 mg/L，Cd：40 mg/L，F(Pb 90+Cd 40)mg/L。4種不同離子配比處理(含ck超純水)，每重復50粒種子，每處理重復2次。

1.2.2種子萌發試驗

挑選大小一致、健康飽滿的油菜種子，用濃度為1%的次氯酸鈉消毒，蒸餾水清洗3～4次后置于鋪有2層濾紙的培養皿(直徑為9 cm)中，每皿50粒；將處理后的種子置于人工培養箱中培養(溫度：25 ℃，光照：16 h、黑暗：8 h)；24 h后記錄種子的萌發數(以胚根突破種皮為標準，記錄露白粒數)；每天觀察情況，直到種子萌發完全(每天補充適量蒸餾水至第1天刻度線)。

1.2.3種子萌發參數的統計

依據油菜種子萌發特點，借助種子萌發特性分析軟件包GERMINATOR[15]中的方法，推算出6個與種子萌發相關指標發芽勢、發芽率、發芽指數、T 50、U 7525和AUC，來衡量種子發芽特性。其中：

發芽勢(%)=(2 d內正常發芽的種子數/每皿總種子數)×100%；

發芽率(%)=(4 d內正常發芽的種子數/每皿總種子數)×100%；

發芽指數=∑(Gt/Dt)，Dt是發芽日數，Gt為第t天的發芽種子數；

AUC(發芽曲線下面積)：將1～4 d的值連接起來，看覆蓋的面積，作為生活力指標；

T 50：發芽率達到50%所需要的時間；

U 7525：發芽率從25%～75%所用的時間。

1.3 數據分析

試驗采用Microsoft Excel 2016軟件和SPSS 20.0軟件進行數據處理和統計分析。運用R 3.6.3統計軟件(https://www.R-project.org/)基于離差平方和法(Ward)的聚類分析。

2 結果與分析

2.1 鉛、鎘及其復合脅迫對油菜萌發的影響

單一和復合脅迫下，發芽勢、發芽率、發芽指數和AUC均表現為降低趨勢(表1)，說明鉛、鎘脅迫對油菜的萌發起抑制作用，但抑制程度存在一定差異。在Cd 40 mg/L離子脅迫下，發芽勢、發芽率、發芽指數、T 50、U 7525、AUC分別降低0.55%、0.73%、1.21%、2.16 h、3.91 h、1.76%，在Pb 90 mg/L離子脅迫下，發芽勢、發芽率、發芽指數、T 50、U 7525、AUC分別降低1.58%、0.93%、1.32%、2.60 h、3.89 h、2.05%，綜合說明，Pb 90 mg/L對油菜萌發的抑制作用強于Cd 40 mg/L。復合脅迫時，相比單一脅迫萌發性狀參數的變化趨勢不盡相同，相比Cd 40 mg/L脅迫，發芽勢、AUC、發芽率呈下降趨勢，發芽指數呈升高趨勢，T 50數值減小，說明所用萌發時間縮短，U 7525數值增大，所用萌發時間增長；相比Pb 90 mg/L單一脅迫，發芽率呈下降趨勢，發芽勢、發芽指數、AUC呈升高趨勢，而T 50所用時間均減少，U 7525所用時間均增加。綜上所述，說明單一和復合脅迫都能加快油菜種子的萌發速率，但是并不能促進種子發芽，反而起著抑制作用，總體上，降低了種子活力。

表1 鉛、鎘及其復合脅迫下油菜萌發參數及影響

表2 無脅迫(ck)油菜萌發參數相關性分析

表3 Cd 40離子脅迫下油菜種子萌發參數相關性分析

表4 Pb 90離子脅迫下油菜種子萌發參數相關性分析

2.2 油菜種子萌發參數相關性分析

由表2～表5可知，脅迫處理前后，6個萌發參數之間均呈極顯著或顯著相關，其中發芽勢、發芽率、發芽指數與T 50呈極顯著負相關，與U 7525呈顯著負相關，與AUC呈極顯著正相關。T 50與U 7525呈顯著正相關，與AUC呈極顯著負相關，而AUC與U 7525呈顯著負相關。但在不同脅迫條件下，相關系數之間存在差異。

表5 復合脅迫下油菜種子萌發參數相關性分析

2.3 油菜鉛、鎘耐性種質的初步篩選

綜合萌發參數對124份油菜種質進行聚類分析，并針對不同類群進行萌發參數方差分析(表6)。

表6 不同離子處理下油菜種質聚類分析和萌發參數方差分析

ck處理下，油菜種質劃分為三大類群，類群之間發芽勢、發芽率、發芽指數、T 50、U 7525和AUC存在明顯差異(圖1)。Cd 40 mg/L離子脅迫時，油菜種質劃分為三大類群，類群之間發芽勢、發芽率、發芽指數、T 50、U 7525和AUC存在差異。其中Cd-Ⅰ群種質對高濃度鎘離子響應靈敏，相應的萌發參數相比ck均有提升(圖2)。Pb 90 mg/L離子脅迫時，油菜種質劃分為三大類群，類群之間發芽勢、發芽率、發芽指數、T 50、U 7525和AUC存在差異。其中Pb-Ⅱ群種質對高濃度鉛離子響應較靈敏，相應的萌發參數相比ck均有顯著提升(圖3)。F脅迫時，油菜種質劃分為三大類群，類群之間發芽勢、發芽率、發芽指數、T 50、U 7525和AUC存在差異。其中F-Ⅰ群種質萌發參數與ck趨于相同，差異較小(圖4)。綜上所述，說明在不同重金屬離子的一定濃度脅迫下，油菜種子對不同重金屬離子響應靈敏不一，但總體萌發參數表現良好。

3 討 論

油菜作為貴州省傳統油料大作物,在貴州各地均有種植。宋春然等對貴州全省采集1 014個土壤樣品檢測分析數據表明[16]，貴州省重金屬污染最為嚴重的是Cd離子污染，其次是Hg離子、Pb離子污染。唐啟琳等[17]研究發現，貴州喀斯特區耕地土壤Cd樣點超標率分別為90%和22%,非喀斯特區耕地土壤Cd樣點超標率分別為30%和12%，土壤環境遭到嚴重污染，影響了油菜的產量。

3.1 Cd、Pb離子對油菜種子萌發的影響

本研究表明，在Cd、Pb離子單一脅迫及復合脅迫都會使得油菜種子發芽勢、發芽率、發芽指數和AUC降低。對重金屬逆境響應敏感度不是很高，一般表現為低濃度促進其萌發，反之高濃度則抑制，而隨濃度的不斷升高，抑制作用逐漸上升。魯先文和丁時和[18]研究發現，Cd2+單一處理濃度≤5 mg/kg、Pb2+單一處理濃度≤10 mg/kg時，對油菜種子萌發的發芽率、發芽勢均為促進作用，高濃度抑制，而當Cd、Pb離子復合處理時，抑制作用更強。紀永[19]研究表明，0.25 mmol/L是Pb2+影響香蒲種子萌發的敏感濃度，3 mmol/L則是Pb2+影響香蒲種子萌發的最大致死濃度。孫杰等研究發現，Pb離子對油菜種子萌發影響不大，但對油菜苗的生長發育起著強抑制作用[20]。

3.2 基于萌發參數對油菜鉛、鎘耐性種子選育

為降低油菜種子萌發遺傳差異，篩選適合貴州高濃度Cd、Pb離子生長的油菜種質。基于6個萌發參數，將124份油菜種子聚類分析，群體間方差分析揭示：ck脅迫時，油菜ck-Ⅰ群體115份具有較高的發芽指數，T 50和U 7525數值較小，表明該群體種質高發芽率和較一致的發芽整齊度；Cd 40 mg/L離子脅迫時，油菜Cd-Ⅰ群體94份具有較高的發芽指數和較一致的發芽整齊度；Pb 90 mg/L離子脅迫時，油菜Pb-Ⅱ群體67份具有較高的發芽指數和較一致的發芽整齊度；F處理時，油菜F-Ⅰ群體111份具有較高的發芽指數和較一致的發芽整齊度。由此可篩選油菜ck-Ⅰ、Cd-Ⅰ、Pb-Ⅱ和F-Ⅰ群體為本次研究的推薦群體。